小鼠哮喘模型Rac1水平的改变及其与ILC2相关细胞因子的关系

发布时间：2017-05-06 17:20

  本文关键词：小鼠哮喘模型Rac1水平的改变及其与ILC2相关细胞因子的关系，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过建立小鼠哮喘模型,检测Rac1在小鼠哮喘模型前后相关组织中表达水平的改变情况,并分析Rac1与2型固有淋巴细胞(ILC2)相关细胞因子如IL-5、IL-33、IL-13表达的关系,观察其对气道炎症的影响,探讨Rac1调节免疫应答反应类型和参与哮喘病理损伤的可能机制,为进一步深入研究哮喘病的发病机制奠定基础,拓展哮喘病临床干预的新思路。方法:1.卵清蛋白(OVA)哮喘模型的建立:哮喘建模参照文献并稍加改进,即实验组小鼠在第1d和第11d分别腹腔注射50μg OVA和10%氢氧化铝佐剂,对照组注射相等量的生理盐水(NS),第22d开始实验组各小鼠给予雾化吸入2%的OVA与生理盐水的混合溶液,激发小鼠的I型超敏反应,1次1小时,每天雾化1次、一连5d。同时,正常组小鼠给予吸入相等的NS。2.Rac1抑制剂(EHT1864)干预试验:在建模过程中,于雾化前三天连续给小鼠腹腔注射EHT1864,其他步骤同上述哮喘模型建立。EHT1864粉剂在使用前用生理盐水溶解并充分混匀,用药量为40mg\kg。3.定量-PCR检测m RNA:取小鼠支气管肺泡灌洗、外周血单个核细胞,经离心获得细胞沉淀;取左边肺组织,充分剪碎研磨得到组织悬液。于上述细胞或组织悬液加入Trizol以裂解细胞并获取总RNA,然后再进行逆转录反应合成c DNA。继而做实时荧光定量PCR,检测Rac1及ILC2相关细胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)m RNA的表达。4.酶联免疫吸附试验:取小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)或眼球外周血,经离心后得到灌洗液上清和外周血血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测ILC2相关的细胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)蛋白表达水平。5.组织切片病理观察:取小鼠右肺组织置于福尔马林中经固定、石蜡包埋等一系列过程制成切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察病理表现。6.荧光抗体染色:取小鼠支气管置于福尔马林中经固定、石蜡包埋等一系列过程制作成石蜡切片,再用直接法进行免疫荧光抗体染色,检测支气管中Rac1的表达情况。7.采用Graph Pad Prism5软件进行统计分析:对哮喘小鼠肺组织Rac1和细胞因子(IL-5,IL-33和IL-13)的表达水平进行直线相关分析,组间均数比较采用两样本非配对T检验,相关性分析选用Pearson法,P0.05,表明差异有统计学意义,多组间的统计分析采用0ne-way ANOVA,P0.05,表明差异有统计学意义。结果:1.通过哮喘模型制作过程对小鼠的观察可见,哮喘组小鼠表现为烦躁不安,出现频繁瘙痒的行为,同时还伴有呼吸加深加快、打喷嚏、大小便失禁、擤鼻等典型的哮喘表现,而对照组无明显异常表现。2.肺组织病理观察结果:HE染色显微镜下可见,哮喘组小鼠肺泡间及周围小血管出现大量炎症细胞,如嗜酸性粒细胞浸润、气道内杯状细胞肥大增生、血清总Ig E及OVA-Ig E含量均高于对照组。而对照组小鼠可见,肺组织气道结构清晰、气管周围无细胞浸润、炎症性改变不明显。3.免疫荧光分析表明:哮喘模型小鼠Rac1的水平与正常小鼠相比显著下降,EHT1864干预后,Rac1的表达进一步下调。4.定量RT-PCR分析结果:哮喘小鼠肺组织或肺泡灌洗液Rac1 m RNA表达水平均明显低于正常对照组,使用EHT1864干预后,Rac1水平则进一步降低。5.小鼠肺组织表达ILC2相关细胞因子的检测:通过分析模型组与正常组目的基因m RNA表达水平,结果显示,哮喘小鼠肺组织的IL-5、IL-33和IL-13的水平与正常组小鼠相比均显著增高;EHT1864处理组的IL-5、IL-33和IL-13的水平上调尤为显著。此结果表明Rac1的降低与ILC2相关细胞因子水平的升高存在着紧密的联系。6.ELISA检测外周血上清IL-5、IL-33和IL-13蛋白表达水平的结果表明,哮喘模型组小鼠上述细胞因子水平均高于对照组。7.分析肺组织中Rac1与IL-5、IL-33和IL-13m RNA表达水平关系的相关性结果显示,哮喘小鼠肺组织Rac1的m RNA水平与IL-5、IL-33和IL-13的m RNA水平均显示明显的负相关。结论:在哮喘小鼠,IL-5、IL-33和IL-13的m RNA和蛋白表达水平与对照组相比都显著增高,同时Rac1的表达却显著下降。相关性分析表明Rac1和ILC2s相关细胞因子(IL-5,IL-33,IL-13)之间存在显著地负相关。为了进一步证明Rac1在哮喘发病机制中的作用,在小鼠激发之前给予EHT1864干预后,随着Rac1表达水平的进一步下调,导致ILC2s相关细胞因子水平明显增高,同时小鼠的哮喘症状及肺组织组损伤加重。这些结果可以推测Rac1可以影响哮喘的发病过程,如果将Rac1的受体激动剂用于哮喘病人,有可能会有效改善炎症状态。进一步研究Rac1在哮喘中的作用,有利于了解哮喘的免疫机制,可以帮助我们找到预防和治疗哮喘的新靶标。
【关键词】：哮喘 ILC2s Rac1 EHT1864 细胞因子
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R562.25;R-332
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 绪论13-24
• 1.1 哮喘与免疫失衡14-16
• 1.1.1 哮喘的发生14-15
• 1.1.2 IL-33参与哮喘的发生15-16
• 1.2 ILC2细胞16-18
• 1.2.1 ILC2细胞的特点与功能16-17
• 1.2.2 ILC2细胞与哮喘17-18
• 1.3 Rac118-21
• 1.3.1 Rac1的特点与功能18-19
• 1.3.2 Rac1与哮喘19-20
• 1.3.3 Rac1的抑制剂EHT186420-21
• 1.4 本实验的研究目的、方法、实验设计方案及意义21-24
• 1.4.1 研究目的21-22
• 1.4.2 研究方法22
• 1.4.3 实验设计22-23
• 1.4.3.1 研究思路22
• 1.4.3.2 技术路线22-23
• 1.4.4 实验研究意义23-24
• 第二章 OVA哮喘模型的建立与鉴定24-32
• 2.1 实验仪器和材料24-26
• 2.1.1 实验动物24
• 2.1.2 主要试剂24-25
• 2.1.3 主要溶液配制25
• 2.1.4 主要仪器25-26
• 2.2 试验方法26-29
• 2.2.1 小鼠OVA哮喘模型的建立26
• 2.2.2 炎症标本采集操作步骤26-28
• 2.2.3 肺组织切片HE染色28
• 2.2.4 酶联免疫吸附法（ELISA）检测外周血上清中OVA特异性IgE和总IgE水平28-29
• 2.2.5 统计学分析29
• 2.3 实验结果29-31
• 2.3.1 哮喘小鼠的表现29
• 2.3.2 小鼠肺组织切片病理改变29-30
• 2.3.3 小鼠血清OVA-IgE和总IgE30-31
• 2.4 讨论31-32
• 第三章 哮喘小鼠Rac1以及ILC2相关细胞因子的检测32-45
• 3.1 实验仪器和材料33-34
• 3.1.1 实验仪器33
• 3.1.2 实验试剂和材料33-34
• 3.1.3 实验溶液配制34
• 3.2 实验方法34-38
• 3.2.1 免疫荧光检测支气管Rac1表达34-35
• 3.2.2 各标本总RNA的提取35
• 3.2.3 将RNA逆转录合成CDNA35-36
• 3.2.4 引物的设计与合成36-37
• 3.2.5 荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测mRNA水平37
• 3.2.6 酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆和灌洗液上清IL-5、IL-13和IL-33蛋白水平37-38
• 3.2.7 统计学分析38
• 3.3 实验结果38-43
• 3.3.1 支气管Rac1免疫荧光蛋白表达水平38-39
• 3.3.2 肺组织、外周血、肺泡灌洗液中Rac1的mRNA表达39-40
• 3.3.3 哮喘模型组ILC2相关细胞因子水平的改变40-41
• 3.3.4 肺组织中Rac1与ILC2相关细胞因子的相关性分析41-43
• 3.4 讨论43-45
• 第四章 Rac1抑制剂EHT1864对ILC2s特征性细胞因子表达的影响45-54
• 4.1 实验仪器和材料46-47
• 4.1.1 实验仪器46-47
• 4.1.2 实验试剂和材料47
• 4.1.3 实验溶液配制47
• 4.2 实验方法47-48
• 4.2.1 抑制剂EHT1864在模型中的使用47
• 4.2.2 免疫荧光检测支气管Rac1表达47
• 4.2.3 肺泡灌洗液，小鼠眼球外周血的分离47-48
• 4.2.4 各标本RNA的提取，逆转录，引物的设计与合成48
• 4.2.5 提取外周血中单个核细胞48
• 4.2.6 荧光定量PCR法检测各个标本各基因mRNA水平48
• 4.2.7 酶联免疫吸附法（ELISA）检测灌洗液上清，，血清中细胞因子蛋白水平48
• 4.2.8 统计学分析48
• 4.3 实验结果48-52
• 4.3.1 小鼠支气管免疫荧光Rac1抗体染色48-50
• 4.3.2 小鼠肺组织、外周血中Rac1 mRNA的改变50
• 4.3.3 小鼠肺组织HE染色50-51
• 4.3.4 小鼠肺组织中IL-33 mRNA水平以及血浆、肺泡灌洗液IL-33蛋白表达水平的改变51-52
• 4.4 讨论52-54
• 第五章 主要结论与展望54-56
• 5.1 主要结论54
• 5.2 展望54-56
• 参考文献56-63
• 致谢63-65
• 攻读硕士期间已发表与待发表的文章65-66
• 英文缩写索引66-67
• 图标清单67

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本文编号：348830