胶原样结构巨噬细胞受体介导的线粒体凋亡在染矽尘大鼠肺纤维化中的作用

发布时间：2017-05-10 15:09

  本文关键词：胶原样结构巨噬细胞受体介导的线粒体凋亡在染矽尘大鼠肺纤维化中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的1通过抑制肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophage, AM）表面胶原样结构巨噬细胞受体（Macrophage receptor with collagenous structure, MARCO）及线粒体凋亡通路相关靶点后检测AM内活性氧（Reactive oxygen specises, ROS）及线粒体膜电位变化水平，肺组织MARCO、细胞色素C（Cytochrome C, CytC）、天冬半胱氨酸特异性蛋白-9（Cysteinyl aspartate specific protease-9, Caspase-9）、Caspase-3、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2assioated X protein, Bax）水平，探讨MARCO介导的肺泡巨噬细胞线粒体凋亡通路发生机制。2通过检测肺组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平，观察肺组织病理变化，分析线粒体凋亡通路在矽肺纤维化发生发展中的作用。3通过比较矽肺形成前的预防性干预措施与矽肺形成后的治疗性干预措施对染矽尘大鼠各指标的不同影响，探讨不同时段干预措施的疗效。 对象与方法无特定病原体级健康成年雄性SD大鼠176只按体重随机分为6组：生理盐水对照组（24只）、矽肺模型组（24只）、 N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine, NAC）组（32只）、环孢霉素A（Cyclosporin A, CsA）组（32只）、Caspase-9抑制剂组（32只）、多聚鸟苷酸（Polyguanylic acid, PolyG）组（32只），各组按照施加干预的时间点不同分为预防组和治疗组，预防性及治疗性干预均设置后续观察组（继续观察28天）。除生理盐水对照组外，其余各组均进行矽肺造模。各预防组大鼠自造模当天开始给予不同的干预处理，分别于染尘后第28天、第56天处死大鼠各8只；治疗组大鼠于造模28天后给予不同的干预处理，分别于染尘后第56天、第84天处死大鼠各8只。收集左侧肺泡灌洗液，分离纯化AM，流式细胞术检测线粒体去极化率和ROS阳性率；取左肺组织适量，实时定量荧光聚合酶链式反应（Real-time PCR）分析Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA表达水平；取适量肺组织匀浆、细胞裂解后，免疫印迹法测定肺组织内MARCO、Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-9和Caspase-3水平。右侧肺组织经多聚甲醛固定，常规制作石蜡切片，苏木素-伊红染色观察肺组织病理变化。 结果1不同组别大鼠肺组织病理变化。生理盐水对照组大鼠肺组织结构清楚，肺泡壁薄，但肺间质有轻微炎症；矽肺模型组大鼠肺组织内有炎细胞浸润，以淋巴细胞和巨噬细胞渗出为主，出现了典型的纤维性结节，结节由巨噬细胞和成纤维细胞构成，可见程度不同的肺泡壁和小血管壁增厚，以结节处增厚更为显著，随着染尘时间的延长矽结节数量增多，部分矽结节出现了融合；NAC组、CsA组、Caspase-9抑制剂预防组和和PolyG组大鼠肺组织均未见细胞性结节或矽结节，Caspase-9抑制剂治疗组有散在的细胞性结节，但各组均有普遍的炎细胞浸润，随着观察时间的延长，炎症改变均出现了不同程度的缓解，以PolyG组减轻最为显著，但各组大鼠肺组织均有肺气肿现象。2不同组别大鼠AM线粒体凋亡通路相关蛋白含量比较。染尘后第28d、56d和84d生理盐水对照组间大鼠肺组织MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax和Bcl-2水平差异均无统计学意义（P0.05），矽肺模型组大鼠肺组织除Bcl-2含量随观察时间延长减少外，其他蛋白水平均随观察时间延长增加（P0.05）。NAC组及CsA组（预防性和治疗性）大鼠肺组织MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3和Bax含量均高于同期生理盐水对照组，但低于矽肺模型组，Bcl-2含量较矽肺模型组高，生理盐水对照组低（P0.05）；染尘后第28d、第56d Caspase-9抑制剂组（预防性及治疗性）大鼠肺组织CytC与同期矽肺模型组相比差异均无统计学意义（P0.05），其他指标均与NAC组趋势一致；与相应生理盐水对照组比较，染尘后第28d PolyG预防组大鼠肺组织MARCO及CytC差异无统计学意义，染尘后第56d PolyG预防组MARCO、CytC、Caspase-3和Bax差异无统计学意义（P0.05），其他指标与NAC组趋势一致。3不同组别大鼠AM内ROS含量及线粒体膜电位变化水平。染尘后第28d、56d和84d生理盐水对照组间大鼠AMROS阳性率和线粒体膜电位去极化率均低于相应矽肺模型组（P0.05）；NAC组及CsA组（预防性和治疗性）大鼠AM ROS阳性率和线粒体膜电位去极化率均高于同期生理盐水对照组，但低于矽肺模型组（P0.05）；染尘后第28d Caspase-9抑制剂预防组大鼠AM ROS阳性率与同期矽肺模型组比较差异无统计学意义（P0.05），其他指标均与NAC组趋势一致；染尘后第56d PolyG预防组大鼠AM ROS阳性率与同期生理盐水对照组比较差异无统计学意义（P0.05），其他指标均与NAC组趋势一致。4不同组别大鼠肺组织细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平分析。染尘后第28d、56d和84d生理盐水对照组间大鼠肺组织Ⅰ型前胶原mRNA表达水平逐渐升高（P0.05），Ⅲ型前胶原mRNA表达水平差异无统计学意义（P0.05）；矽肺模型组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平均随染尘时间延长而增加（P0.05）；NAC组、CsA组和Caspase-9抑制剂组（预防性和治疗性）两指标均高于同期生理盐水对照组，低于矽肺模型组（P0.05）；与相应生理盐水对照组比较，PolyG预防组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平均无统计学差异，但均低于矽肺模型组，PolyG治疗组两指标与NAC组趋势一致。5不同干预时段对不同组别大鼠AM线粒体凋亡通路相关指标的影响。染尘后第28d各预防组与染尘后第56d各相应治疗组比较，生理盐水对照组大鼠肺组织MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平，AM ROS阳性率和线粒体膜电位去极化率差异均无统计学意义（P0.05），Ⅰ型前胶原mRNA表达水平降低（P0.05）；矽肺模型组大鼠AM ROS阳性率和线粒体膜电位去极化率差异无统计学意义（P0.05），肺组织Bcl-2水平升高，，其他指标均降低（P0.05）；NAC组、CsA组和PolyG组大鼠上述指标除Bcl-2升高外，其他指标均降低（P0.05）；Caspase-9抑制剂组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平、AM线粒体膜电位去极化率差异无统计学意义（P0.05），Bcl-2含量升高，其他指标均降低（P0.05）。 结论1抑制MARCO及线粒体通路相关靶点后，肺泡巨噬细胞内ROS及线粒体膜电位变化水平，肺组织MARCO、CytC、Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2水平均出现不同程度的下调，表明MARCO结合二氧化硅在肺泡巨噬细胞线粒体凋亡通路启动中发挥着重要的作用。2抑制MARCO及线粒体通路相关靶点后，各处理组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA水平及肺组织病理改变均出现不同程度的减轻，表明线粒体凋亡通路的启动在矽肺纤维化发生发展中发挥重要作用。3早期采用PolyG阻断二氧化硅与MARCO的结合或采用线粒体通路信号转导抑制剂对染矽尘大鼠进行预防性干预可有效抑制肺纤维的形成；矽肺形成后的治疗性干预可不同程度逆转已形成的肺纤维化病理改变，并且早期阻断上游通路效果较为显著。
【关键词】：MARCO 矽肺 肺泡巨噬细胞 线粒体凋亡 肺纤维化
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R135.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-15
• 引言15-18
• 第1章 实验研究18-59
• 1.1 材料与方法18-26
• 1.1.1 实验动物18-19
• 1.1.2 主要仪器和试剂19-23
• 1.1.3 研究内容23
• 1.1.4 实验方法23-26
• 1.1.5 统计学分析26
• 1.1.6 质量控制26
• 1.2 结果26-47
• 1.2.1 预防性干预对大鼠肺组织纤维化程度的影响及其机制26-36
• 1.2.2 治疗性干预对大鼠肺组织纤维化程度的影响及其机制36-45
• 1.2.3 预防组与相应治疗组各监测指标比较45-47
• 1.3 讨论47-52
• 1.3.1 PolyG 抑制 MARCO 后对肺纤维化的影响48-49
• 1.3.2 NAC 抑制 ROS 后对肺纤维化的影响49-50
• 1.3.3 CsA 抑制 PTP 开放后对肺纤维化的影响50-51
• 1.3.4 Caspase-9 抑制剂抑制 Caspase-9 后对肺纤维化的影响51-52
• 1.4 结论52-53
• 参考文献53-59
• 第2章 综述 粉尘致肺纤维化机制研究现状59-68
• 2.1 AM 对粉尘的吞噬59-61
• 2.1.1 粉尘的形状59-60
• 2.1.2 清道夫受体介导的 AM 吞噬作用60-61
• 2.1.3 其他相关受体及调控因子61
• 2.2 线粒体通路的细胞凋亡假说61-63
• 2.2.1 凋亡刺激物的产生61-62
• 2.2.2 线粒体凋亡通路的启动62-63
• 2.2.3 其他凋亡通路63
• 2.3 应用与展望63
• 参考文献63-68
• 致谢68-69
• 导师简介69-70
• 作者简介70-71
• 学位论文数据集71

【参考文献】

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本文编号：355003