乳铁蛋白抑制SARS冠状病毒感染宿主细胞的机理研究

发布时间：2023-02-06 12:58

　　自从2002年11月在中国广东省爆发严重急性呼吸综合症(SARS)以来,人们对SARS的病原体,一种新型的冠状病毒,SARS冠状病毒(SARS-CoV)进行了详细的研究[1]。SARS-CoV表面最重要的膜蛋白一刺突蛋白(Spike protein)负责与受体结合并进入细胞[1-4]。实验证明ACE2是SARS-CoV的一种重要的受体,主要分布于Ⅰ型和Ⅱ型肿泡上皮细胞,小肠上皮细胞以及肾脏近曲小管的刷状缘上[5]。但是,人们已经发现除了ACE2作为主要受体之外,SARS-CoV感染宿主细胞很可能还需要其他辅助分子的协助或者还有其他受体介导SARS-CoV进入细胞[2,5]。 在被SARS-CoV感染的病人的外周血单核细胞(PBMC)中,乳铁蛋白的表达水平会急剧上调[7]。乳铁蛋白具有多种生物学功能,能够抑制细菌,病毒,真菌等微生物的感染,是在机体内参加先天免疫反应的一种重要蛋白[8-11]。本实验发现乳铁蛋白能够抑制SARS假病毒(Pseudovirus)感染293E-ACE2-Myc细胞,这种抑制效应是剂量依赖的。在体外乳铁蛋白并不干扰Spike蛋白和ACE2受体的结合,而是通过结合...

【文章页数】：84 页

【学位级别】：博士

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目录
中文摘要
Abstract
英文略语表
前言
1 实验材料
    1.1 质粒
    1.2 菌株
    1.3 细胞株
    1.4 主要仪器设备
    1.5 工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker
    1.6 主要化学试剂
    1.7 细胞培养用耗材
    1.8 试剂盒
    1.9 主要溶液配方
        1.9.1 培养基的配制
        1.9.2 制备感受态细胞相关溶液
        1.9.3 抗生素的配制
        1.9.4 大量提取质粒DNA的相关溶液
        1.9.5 DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制
        1.9.6 细胞冻存液的配制
        1.9.7 细胞裂解液的配制
        1.9.8 SDS-PAGE蛋白质电泳及相关缓冲液的配制
        1.9.9 蛋白纯化相关缓冲液配制
        1.9.10 常用缓冲液的配制
        1.9.11 细胞免疫荧光实验缓冲液的配制
    1.10 PCR引物
    1.11 主要抗体
2 实验方法
    2.1 乳铁蛋白(lactoferrin)的PCR引物设计
    2.2 PCR扩增
    2.3 酶切消化
    2.4 连接
    2.5 转化
    2.6 鉴定
    2.7 感受态细胞的制备
    2.8 质粒DNA的小提
    2.9 质粒DNA的大量提取
    2.10 重组质粒DNA浓度的测定
    2.11 DNA的线性化及纯化回收
    2.12 贴壁细胞培养
    2.13 稳定表达细胞株的构建
    2.14 细胞冻存
    2.15 细胞复苏
    2.16 细胞裂解
    2.17 Western Blotting检测方法
    2.18 SARS-CoV刺突蛋白S1190-Fc及对照Fc蛋白的制备
    2.19 假病毒的包装
    2.20 假病毒滴度测定
    2.21 荧光显微镜观察乳铁蛋白抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc细胞
    2.22 Western blot分析乳铁蛋白抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc细胞情况
    2.23 流式细胞术检测乳铁蛋白抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc细胞情况
    2.24 乳铁蛋白抑制SARS-CoV刺突蛋白S1190-Fc结合293E-ACE2-Myc细胞检测
    2.25 ELISA检测乳铁蛋白对S1190-Fc和293E-ACE2-Myc结合的影响
    2.26 乳铁蛋白荧光标记
    2.27 Confocal检测乳铁蛋白在293E-ACE2-Myc细胞上的定位
    2.28 肝素对乳铁蛋白结合293E-ACE2-Myc细胞的影响
    2.29 肝素对乳铁蛋白抑制S1190-Fc结合293E-ACE2-Myc细胞的中和作用
    2.30 肝素对乳铁蛋白抑制SARS假病毒进入293E-ACE2-Myc细胞的中和作用
    2.31 肝素对Spike蛋白结合到293E-ACE2-Myc细胞上的抑制作用
    2.32 肝素对SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc细胞的抑制作用
    2.33 肝素酶消化细胞表面的硫酸乙酰肝素对Spike蛋白结合到293E-ACE2-Myc细胞上的抑制作用
    2.34 肝素酶消化细胞表面的硫酸乙酰肝素对SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc细胞的抑制作用
3 实验结果
    3.1 构建pEAK13CD5L-LF-TEVFc和pEAK13CD5L-LF质粒
    3.2 瞬时转染细胞,Western Blot检测乳铁蛋白的表达
    3.3 SARS假病毒的包装
    3.4 SARS假病毒的滴度测定
    3.5 S1190-Fc及Fc蛋白的表达纯化
    3.6 乳铁蛋白能够抑制SARS假病毒进入293E-ACE2-Myc细胞
    3.7 乳铁蛋白能够抑制SARS-CoV的Spike蛋白结合到宿主细胞上
    3.8 乳铁蛋白不干扰Spike蛋白和ACE2的相互作用
    3.9 乳铁蛋白结合于细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)
    3.10 肝素可以中和乳铁蛋白对Spike蛋白的抑制作用
    3.11 肝素可以部分中和乳铁蛋白对SARS假病毒进入293E-ACE2-Myc细胞的抑制作用
    3.12 肝素可以抑制Spike蛋白结合到293E-ACE2-Myc细胞上
    3.13 肝素可以抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc细胞
    3.14 肝素酶消化细胞表面的硫酸乙酰肝素可以抑制Spike蛋白结合到293E-ACE2-Myc细胞上
    3.15 肝素酶消化细胞表面的硫酸乙酰肝素可以抑制SARS假病毒感染293E-ACE2-Myc细胞
4 讨论
5 参考文献
综述1
    参考文献
综述2
    参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3736041