增强Foxp3基因表达对支气管哮喘发病的干预研究

发布时间：2017-05-20 12:10

  本文关键词：增强Foxp3基因表达对支气管哮喘发病的干预研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：支气管哮喘(哮喘)是严重威胁人类健康的一种疾病,全世界有大约3亿哮喘患者,每年有25000人死于哮喘。哮喘是由T淋巴细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症性疾病,气道慢性炎症导致气道高反应性(hyperresponsiveness, AHR)的形成和气道重构。哮喘引起的社会和家庭问题日益成为人类社会的沉重负担。 至今已发现有多种辅助性T细胞(helper T cell, Th cell),包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞等等。在哮喘的发病机制中,针对环境中过敏原而产生的Th2型细胞因子起了重要的作用。研究表明Th1/Th2细胞平衡失调即Th0细胞向Th2细胞分化过度,在过敏性疾病的发生中起重要作用。Th2细胞通过分泌IL-4、IL-5、 IL-9、IL-13等多种细胞因子来发挥促炎作用。在哮喘患者中,Th2细胞被激活,分泌一系列Th2型细胞因子来调节IgE的产生、炎症细胞的浸润、气道粘膜高分泌及气道结构的改变。另一方面,机体对过敏原免疫耐受缺陷亦是导致哮喘发生的主要原因之一,健康者对过敏原的反应表现为免疫耐受从而避免Th2型反应,而哮喘患者的耐受途径存在异常从而不能对过敏原发生免疫耐受,诱导机体产生Th2型免疫反应。 调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs),尤其是CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Tregs),在维持机体对过敏原的免疫耐受中起主要作用。CD4+CD25+Tregs约占正常人和小鼠的外周血及脾脏组织CD4+T细胞的5%～10%. CD4+CD25+Tregs可分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β来发挥免疫抑制作用,能够抑制Th2细胞分化、增殖及细胞因子的产生,对于Th2介导的疾病(如哮喘)是一种新的、有希望的治疗途径。Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor)称叉状头/翅膀状螺旋转录因子,在CD4+CD25+Tregs特异性表达,且在幼稚前体T细胞向Tregs表型分化中起着重要的作用。 迄今为止,人们已经发现诸多因子能招募CD4+CD25+Tregs或诱导Foxp3在CD4+CD25-T细胞中表达,从而降低Th2细胞免疫反应,抑制哮喘的病理过程和症状表现。但是这些研究都是利用全身性的方法,由于对体内其他器官会有副作用,难免会产生潜在性的问题。所以我们希望在肺组织局部增强Foxp3基因的表达,来观察其对哮喘的发生是否有保护作用。在本研究中,我们成功构建了携带有小鼠Foxp3基因的逆转录病毒载体——Foxp3/PMX,然后通过气道滴注至OVA诱导的哮喘模型小鼠体内,观察小鼠肺组织炎症、气道高反应性、肺组织中Th2及Tregs百分比、BALF中炎症因子含量等的变化,同时检测抑制性细胞因子IL-10和TGF-(3的表达情况。结果发现增强肺部Foxp3基因的表达对哮喘的发病有保护作用,本研究为哮喘的免疫治疗提供了新的方向。 目的：通过经气道滴注携带有小鼠Foxp3基因的逆转录病毒,观察增强肺部Foxp3基因表达对哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性的影响,对肺组织中Th2及Tregs细胞百分比的影响。 方法：实验采用BALB/c小鼠,分生理盐水阴性对照组(Saline组)、哮喘组(OVA组)、Foxp3/PMX治疗组(Foxp3组)及Empty/PMX治疗组(Control组)四组,其中Foxp3/PMX治疗组和Empty/PMX治疗组分别经气道滴注Foxp3/PMX和Empty/PMX逆转录病毒,50μl/次,共3次。最后一次抗原激发后24小时检测小鼠气道反应性,Q-PCR和Westernblot分别检测肺组织Foxp3基因和蛋白表达水平,肺组织病理切片分别行HE和PAS染色检测炎症细胞浸润和气道粘液分泌情况,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)行总细胞计数及炎症细胞分类计数。流式细胞术检测肺组织单核细胞中CD4+oxp3+细胞及CD4+IL-4+细胞占总的CD4+T细胞百分比。ELISA法检测BALF中细胞因子IL-4、IL-13、IL-17、IL-10及TGF-β水平,Q-PCR检测肺组织IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、 IL-10及TGF-β mRNA表达水平。 结果：①OVA组小鼠肺组织中Foxp3mRNA及蛋白水平均较Saline组小鼠明显升高,OVA组小鼠肺组织淋巴细胞中CD4+Foxp3+细胞、CD4+IL-4+细胞均较Saline组小鼠明显增加。经气道滴注Foxp3/PMX逆转录病毒进一步增加肺组织中Foxp3mRNA及蛋白水平,同时伴随着CD4+Foxp3+细胞百分比的增加及CD4+IL-4+细胞百分比的减少。②OVA组小鼠气道反应性,BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数,肺组织炎症以及黏液分泌均较Saline组明显增加。与Control组相比,经气道滴注Foxp3/PMX逆转录病毒显著降低了哮喘小鼠气道反应性、BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞数目,抑制了肺组织的气道炎症以及黏液分泌。③经气道滴注Foxp3/PMX逆转录病毒降低了肺组织中Th2细胞及Th17细胞免疫反应相关的IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A mRNA表达水平,降低了BALF中IL-4、IL-13、L-17细胞因子含量。④经气道滴注Foxp3/PMX逆转录病毒增加了肺组织中抑制性细胞因子IL-10及TGF-β mRNA表达水平,及肺泡灌洗液中IL-10及TGF-β1细胞因子含量。 结论：本实验通过Foxp3/pMX逆转录病毒气道滴注至哮喘小鼠体内,证明增强肺组织局部Foxp3基因的表达,可增加肺部CD4+Foxp3+细胞百分比及降低CD4+IL-4+细胞百分比,显著降低哮喘小鼠的气道炎症、气道反应性、气道粘液分泌,改善哮喘小鼠肺部TH2、TH17细胞介导的免疫反应,同时伴随着肺部抑制性细胞因子IL-10、TGF-β水平的增加。
【关键词】：Foxp3 哮喘 调节性T细胞 Th2细胞
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 缩略语中英文对照12-14
• 目录14-15
• 前言15-18
• 材料与方法18-39
• 实验结果39-52
• 讨论52-55
• 结论55-56
• 参考文献56-61
• 综述61-70
• 参考文献67-70
• 作者简历70

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本文编号：381573