SARS病人组织中SARS冠状病毒全基因组克

发布时间：2023-06-01 22:38

　　2003年春季在我国广东、北京等地人群中爆发了以高热、寒战、肌肉痛、干咳、呼吸困难、高度接触性传染为主要特点的传染性疾病，随后该疾病被正式命名为“严重急性呼吸综合症(简称SARS)”。病因学研究表明，SARS的病因是一种新型冠状病毒，世界卫生组织将其命名为SARS相关冠状病毒(SARS-associated coronavirus，SARS-CoV)。作为一种新发现的病毒，目前对其遗传学和复制、装配机制等还所知甚少，因此开展此方面研究具有重要意义。 笔者参与了SARS病原的调查工作。为深入阐明北京地区流行的SARA-CoV的病原学特征，首先从SARS病人病料标本中进行病毒分离试验。将SARS病人临床标本，如咽拭子、痰液和肺组织标本接种Vero细胞，连续传代后，可观察到显著的细胞病理改变(CPE)，表明可能标本中可能存在病毒。电镜观察分离物培养上清负染样本，，可见到形态与典型冠状病毒外观相似的病毒样颗粒；用SARS病人康复期血清进行的间接免疫荧光试验，显示分离物接种培养的细胞胞浆内存在特异性荧光，证实培养物中存在与SARS-CoV相关的病毒抗原；提取分离物总RNA进行RT-PCR...

【文章页数】：135 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 SARS冠状病毒分子生物学进展
    一 SARS-CoV基因组学研究进展
    二 SARS-CoV非结构蛋白质分子生物学研究进展
        1.2.1 SARS-CoV多聚蛋白的RNA加工酶类似物
        1.2.2 SARS-CoV特异蛋白酶
            1.2.2.1 SARS-CoV的PL2^pro酶
            1.2.2.2 SARS-CoV的3CL^pro蛋白酶
        1.2.3 SARS-CoV的其他非结构蛋白质
    三 SARS-CoV主要结构蛋白质分子生物学
        1.3.1 SARS-CoV S蛋白质分子生物学
            1.3.1.1 S蛋白质概述
            1.3.1.2 S蛋白质受体结合功能与SARS-CoV的受体
            1.3.1.3 S蛋白质与膜融合
            1.3.1.4 S蛋白质分子免疫学和膜融合抑制肽
            1.3.1.5 S蛋白质其他细胞生理效应
        1.3.2 SARS-CoV N蛋白质分子生物学和分子免疫学
            1.3.2.1 SARS-CoV N蛋白质分子生物学
            1.3.2.2 SARS-CoV N蛋白质分子免疫学
        1.3.3 SARS-CoV E蛋白质和M蛋白质分子生物学
            1.3.3.1 SARS-CoV E蛋白质分子生物学
            1.3.3.2 SARS-CoV M蛋白质分子生物学
    四 抗SARS-CoV疫苗及抗病毒药物研究
        1.4.1 SARS-CoV疫苗
            1.4.1.1 SARS-CoV灭活病毒疫苗
            1.4.1.2 SARS-CoV重组蛋白质疫苗与SARS-CoV病毒感染抑制性肽
            1.4.1.3 SARS-CoV DNA疫苗
            1.4.1.4 SARS-CoV DNA免疫与SARS病毒蛋白质疫苗联合应用
            1.4.1.5 SARS-CoV重组活载体疫苗
        1.4.2 干扰素和小分子治疗药物
            1.4.2.1 干扰素
            1.4.2.2 小分子治疗药物
    五 SARS-CoV动物感染试验模型
    六 结语
    七 本章参考文献
第二章 SARS冠状病毒的分离培养和鉴定
    一、材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 病毒分离标本和分离细胞
            2.1.2 试剂、载体、实验仪器和实验场所
        2.2 方法
            2.2.1 病毒的细胞分离培养
            2.2.2 细胞分离物的收获
            2.2.3 病毒培养物鉴定
            2.2.4 套式RT-PCR鉴定SASR-CoV特异性病毒RNA
            2.2.5 特异性扩增片段的回收克隆和测序
            2.2.6 病毒的滴定
    二、结果
        1.病料接种培养的Vero细胞产生CPE现象
        2.电镜观察到感染细胞培养上清中存在冠状病毒样粒子
        3.病料接种Vero培养细胞与SARS病人康复期血清特异性结合
        4.SARS-CoV病毒特异性核酸序列分析结果
        5.分离的SARS-CoV病毒滴度一时间变化关系
    三、讨论
    四、小结
    五、参考文献
第三章 SARS病人肺组织中SARS-COV全基因组CDNA克隆及序列分析
    一、材料与方法
        3.1 材料
            3.1.1 RNA模板
            3.1.2 克隆引物
            3.1.3 PCR仪、工具酶和其他分子生物学常用试剂
        3.2 方法
            3.2.1 RNA模板提取
            3.2.2 SARS-CoV-5#全基因组cDNA克隆
    二 结果
        1.目的片段的克隆和重组质粒初步PCR鉴定
        2.SARS-CoV-5#全基因组cDNA克隆测序
    三、讨论
    四、本章小结
    五、参考文献
    六、本章附录
        1 本章附表
        2.本章附录链接地址
        3.SARS-CoV-5#测序结果
第四章 SARS冠状病毒结构蛋白质基因的表达及其病毒样颗粒的包装试验
    一 材料和方法
        4.1.1 材料
            4.1.1.1 细胞、毒株
            4.1.1.2 试剂和抗体
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 末端重叠拼接PCR法.人工合成密码子优化SASR-CoV结构蛋白质E基因
            4.1.2.2 末端重叠拼接PCR人工合成密码子优化SASR-CoV结构蛋白质M基因
            4.1.2.3 完整M基因组装和测序
            4.1.2.4 PCR方法在M基因C末端引入肽标签FLAG
            4.1.2.5 表达SARS-CoV主要结构蛋白质基因重组杆状病毒载体的构建
            4.1.2.6 重组冠状病毒的包装和滴定
            4.1.2.7 感染重组杆状病毒的细胞内SARS-CoV结构蛋白质基因表达的检测
            4.1.2.8 重组杆状病毒感染Sf9细胞形成细胞内SARS-CoV VLP
    二、结果
        1 优化密码子合成的M、E基因的鉴定
        2 含SARS-CoV结构蛋白质基因杆状病毒重组转座质粒的构建
        3 表达SARS-CoV结构蛋白质的重组杆状病毒的获得与鉴定
            1) 重组杆状病毒基因组Bacmid的PCR鉴定
            2) 重组杆状病毒基因组Bacmid细胞转染包装病毒
            3) 重组杆状病毒表达SARS-CoV结构蛋白质的检测
        4 SARS-CoV VLP的装配
    三、讨论
    四、本章小结
    五、参考文献
    六、本章附录
攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢



本文编号：3827161