bFGF基因转染MSCs对COPD的修复作用及其机制研究

发布时间：2017-05-20 20:21

  本文关键词：bFGF基因转染MSCs对COPD的修复作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：研究外源性碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）对COPD造模大鼠的修复作用及其机制。 方法：全骨髓贴壁细胞培养法分离、培养4-5周SD大鼠的BMSCs，并用CM-Dil做荧光标记。脂质体转染法将bFGF基因转染入BMSCs，用qRT-PCR及Western-blot测转染后bFGF基因及其目的蛋白的表达量。烟熏及脂多糖（LPS）气管滴入复合方法构建COPD大鼠模型。本课题分为5个实验组，共50只大鼠，随机平均分为正常对照组（NC组）、COPD对照组（PC组）、MSCs治疗组（M组）、pcDNA3.1-MSCs治疗组(P组)、bFGF-pcDNA3.1-MSCs治疗组(B组)。NC组：尾静脉注入3ml PBS液作阴性对照，PC组：造模后立即尾静脉注入3ml PBS液作阳性对照，M组：造模后立即尾静脉注入标记的第3代MSCs1×107/3ml PBS液，P组：造模后立即尾静脉注入标记的第3代pcDNA3.1-MSCs1×107/3ml PBS液，B组：造模后立即尾静脉注入标记的第3代bFGF-pcDNA3.1-MSCs1×107/3mlPBS液。以上各组大鼠在给药后30天统一采集动脉血行血气分析检测，行肺泡灌洗术收集肺泡灌洗液计数WBC及N%，并取大鼠肺组织制作冰冻切片观察BMSCs定植情况、HE染色观察其病理形态及测量MAN、MAA及MLI值。 结果：1、成功分离大鼠BMSCs，流式细胞表型检测CD44、CD29阳性，CD34阴性，鉴定成功；2、bFGF基因转染BMSCs后用qRT-PCR检测其基因表达量，结果示转染了bFGF-pcDNA3.1质粒的BMSCs大量表达bFGF基因，较转染了pcDNA3.1空白质粒和未转染的BMSCs明显升高，差异具有显著统计学意义，说明bFGF基因成功转染入BMSCs中并可大量表达其目的基因；3、bFGF基因转染BMSCs后用Western-blot检测其蛋白表达量，结果示转染了bFGF-pcDNA3.1质粒的BMSCs大量表达bFGF目的蛋白，较转染了pcDNA3.1空白质粒和未转染的BMSCs明显升高，差异具有统计学意义，说明bFGF基因成功转染入BMSCs中并可大量表达其目的蛋白；4、标记的BMSCs移植入大鼠体内后28天肺组织病理可见红色点状的呈簇状分布的荧光，说明BMSCs在大鼠肺组织内成功定植；5、血气分析值：PC组、M组、P组、B组均有轻度低氧血症表现，无二氧化碳潴留及酸中毒表现，PC组、M组、P组、B组PO2、SaO2值均低于NC组，差异有统计学意义，其中M组、P组、B组PO2值均高于PC组，差异有统计学意义，而这3组之间差异无统计学意义，但B组PO2值较M组、P组有升高趋势；6、肺泡灌洗液WBC及N%计数：NC组、M组、P组、B组的WBC及N%计数均明显低于PC组，差异具有统计学意义，而其之间差异无统计学意义，，其中B组WBC及N%计数较M组、P组相比无减少趋势，M组、P组、B组3个治疗组WBC及N%计数均稍高于NC组；7、肺组织病理形态参数MAN、MAA：PC组、M组、P组、B组MAN、MAA值均低于NC组，差异有统计学意义，其中M组、P组、B组MAN、MAA值均高于PC组，差异有统计学意义，而这3组之间差异无统计学意义，但B组MAN、MAA值较M组、P组有升高趋势；8、肺组织病理形态参数MLI值：PC组、M组、P组、B组均高于NC组，差异有统计学意义，其中M组、P组、B组MLI值均低于PC组，差异有统计学意义，而这3组之间差异无统计学意义，B组MLI值较M组、P组无下降趋势。 结论：1.外源性bFGF基因成功转染入大鼠BMSCs并可大量表达其目的基因及目的蛋白；2.外源性BMSCs经尾静脉注射后可以到达COPD造模大鼠的肺组织并可成功实现在局部定植；3.外源性bFGF-pcDNA3.1-BMSCs移植治疗对COPD造模大鼠的修复效果较明确，较单纯造模组COPD程度有明显改善，较单纯BMSCs移植治疗组有增加趋势，但差异无统计学意义，因此尚不能推断bFGF有明显的修复COPD作用；4.单纯BMSCs移植治疗对COPD造模大鼠的修复效果较明确。
【关键词】：碱性成纤维细胞生长因子 骨髓间充质干细胞 慢性阻塞性肺疾病 修复
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.9
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 前言11-14
• 第2章 实验材料14-17
• 2.1 实验动物14
• 2.2 实验仪器14-15
• 2.3 实验试剂15-16
• 2.4 其他16-17
• 第3章 实验方法与步骤17-32
• 3.1 实验相关器材的准备与处理17
• 3.2 体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及鉴定17-19
• 3.2.1 原代细胞的提取、分离及传代17-18
• 3.2.2 细胞传代18
• 3.2.3 流式细胞术鉴定细胞表型18-19
• 3.2.4 测潮霉素最低筛选浓度19
• 3.3 bFGF 基因转染大鼠 BMSCs19-29
• 3.3.1 构建载体质粒 pcDNA3.1 以及重组质粒 bFGF-pcDNA3.119-21
• 3.3.2 重组质粒 bFGF-pcDNA3.1 与空白质粒 pcDNA3.1 的转化与提取21-23
• 3.3.3 质粒转染大鼠 BMSCs23-24
• 3.3.4 施加筛选压力筛选稳定转染株24-25
• 3.3.5 检测转染效率25-29
• 3.3.6 BMSCs 移植前的收集和 CM-Dil 体外标记29
• 3.4. 移植外源性 bFGF 基因转染后的 BMSCs 至造模大鼠体内实验29-31
• 3.4.1 动物模型准备29-30
• 3.4.2 实验分组30
• 3.4.3 观察大鼠的一般情况和采集标本30-31
• 3.4.4 大鼠肺组织病理学检测31
• 3.5 统计学方法31-32
• 第4章 实验结果32-38
• 4.1 大鼠 BMSCs 分离培养、鉴定以及测潮霉素筛选最低有效浓度32-33
• 4.1.1 大鼠 BMSCs 分离培养及鉴定32
• 4.1.2 测潮霉素筛选最低有效浓度32-33
• 4.2 质粒的鉴定33-34
• 4.2.1 质粒 DNA 纯度和浓度的测定33
• 4.2.2 质粒酶切电泳33
• 4.2.3 质粒测序鉴定结果33-34
• 4.3 pcDNA3.1-bFGF 质粒及空白 pcDNA3.1 质粒转染大鼠 BMSCs 效率检测34
• 4.3.1 绿色荧光蛋白（GFP）表达34
• 4.3.2 qRT-PCR 检测 bFGF 基因的表达34
• 4.3.3 Western-blot 检测 bFGF 蛋白的表达34
• 4.4 体内实验情况34-38
• 4.4.1 各组大鼠一般情况34-35
• 4.4.2 BMSCs 在各组大鼠肺组织的分布与定位35
• 4.4.3 各组大鼠给药后血气分析结果35-36
• 4.4.4 各组大鼠给药后肺泡灌洗液 WBC 及 N%计数结果36
• 4.4.5 各组大鼠给药后肺组织病理学检查36-38
• 第5章 讨论38-43
• 第6章 结论与展望43-44
• 6.1 结论43
• 6.2 展望43-44
• 致谢44-45
• 参考文献45-48
• 附图48-55
• 攻读学位期间的研究成果55-56
• 综述56-62
• 参考文献61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 方翔;汤兵祥;张曼林;孙芳;胡建平;刘欣欣;;骨髓间充质干细胞移植对肺气肿大鼠的影响[J];郑州大学学报(医学版);2010年03期

2 马慧雨;肖苒;杜晓岩;;荧光活性染料(CM-Dil)对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响[J];口腔颌面外科杂志;2011年04期

3 李宝平;邢万红;路鹏雁;张雷;马捷;;生长因子及骨髓间充质干细胞与肺再血管化修复烟熏大鼠肺气肿模型[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年02期

4 李鲁生;张涵;王成俊;程洪斌;安沂华;;骨髓间充质干细胞的分离方法和生物学特性[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年10期

5 张超凤;区庆坚;王志红;邓兰;郭坤元;;骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病[J];心肺血管病杂志;2011年01期

6 ;增强信心 正确认识 合理治疗——开创慢性阻塞性肺疾病防治的新局面[J];中华结核和呼吸杂志;2007年01期

7 ;Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cells[J];World Journal of Gastroenterology;2004年20期

  本文关键词：bFGF基因转染MSCs对COPD的修复作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：382741