缝隙连接蛋白40与肺血管通透性的相关性研究

发布时间：2017-05-24 12:23

  本文关键词：缝隙连接蛋白40与肺血管通透性的相关性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的观察缝隙连接蛋白40(connexin 40,Cx40)以及参与维持血管屏障完整性的血管内皮细胞钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)在C57BL/6小鼠急性肺损伤模型不同时期的表达变化情况,并探究Cx40与肺血管通透性的功能相关性。方法C57BL/6小鼠腹腔注射内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),以腹腔注射生理盐水为对照组,24小时后,分别行离体肺灌注,平稳灌注后将左心房压提高10cm H2O,检测其肺重量变化情况以确保内毒素引起急性肺损伤模型的可靠性,进而采用蛋白免疫印迹的方法检测腹腔注射LPS后6小时、24小时、3天后Cx40和VE-cadherin蛋白表达情况,以未处理组为空白对照;为研究Cx40与肺血管通透性的功能相关性,在C57BL/6小鼠离体肺灌注系统中使用血小板激活因子(platelet-activating factor,PAF)建立急性肺水肿模型,运用Cx40特异抑制模拟肽gap2740以及非选择性缝隙连接抑制剂甘珀酸(carbenoxolone)进行干预,通过离体肺灌注系统检测gap2740以及甘珀酸对PAF效果的影响,初步确定Cx40与肺血管通透性的功能相关性;使用凝血酶(thrombin)处理人肺血管内皮细胞建立内皮细胞屏障功能破坏(即通透性增高)模型作为对照,运用甘珀酸进行干预,经ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing)检测缝隙连接与肺血管内皮细胞通透性的关系;为进一步探究敲除Cx40基因对肺血管通透性的影响,通过离体肺灌注系统观察PAF对Cx40基因敲除C57BL/6小鼠的影响,记录肺重量变化情况,以使用PAF处理正常C57BL/6小鼠为对照结果腔注射LPS 24小时后其肺重量升高的程度明显高于生理盐水对照组,腹腔注射LPS可有效建立急性肺损伤模型,蛋白免疫印迹检测发现,Cx40蛋白表达在腹腔注射LPS 6小时后明显低于空白对照组,至24小时其蛋白表达水平继续降低,第3天Cx40蛋白表达相较于第24小时的表达有所回升,VE-cadherin的蛋白表达水平变化与Cx40一致;C57BL/6小鼠离体肺灌注实验中,PAF在短时间内就可以引起肺重量急剧升高,导致强烈的肺水肿,而gap2740和甘珀酸均可以显著缓解PAF致肺水肿效应,gap2740和甘珀酸的作用相当;经ECIS检测发现,凝血酶可以明显降低人肺血管内皮细胞的电阻抗,提示人肺血管内皮细胞通透性增加,而甘珀酸可以显著缓解凝血酶的作用;在Cx40基因敲除C57BL/6小鼠离体肺灌注实验中,相较于正常C57BL/6小鼠,PAF引起Cx40基因敲除C57BL/6小鼠发生急性肺水肿的作用明显降低。结论在内毒素引起的相对慢性肺损伤过程中,Cx40与VE-cadherin表达水平逐渐降低,并伴随着血管通透性的增高;两者表达水平在损伤和修复阶段不断发生变化,其变化情况一致。而在PAF以及凝血酶引起的相对急性肺损伤过程中,抑制Cx40以及缝隙连接可以有效缓解肺血管通透性的增加。总而言之,Cx40和VE-cadherin之间的联系以及Cx40和缝隙连接调控肺血管通透性的分子机制有待于更加深入的研究。
【关键词】：急性肺损伤 肺血管通透性 缝隙连接蛋白40 血管内皮细胞钙黏蛋白
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-16
• 第一节 Cx40及VE-cadherin在肺损伤不同时期的表达变化情况16-21
• 1 实验材料16
• 1.1 实验仪器16
• 1.2 实验试剂与药品16
• 2 实验方法16-17
• 2.1 腹腔注射LPS 24h后行离体肺灌注检测Kf16-17
• 2.2 Western Blot方法检测Cx40和VE-cadherin表达17
• 2.3 统计学方法17
• 3 结果17-21
• 3.1 LPS有效建立急性肺损伤模型17-18
• 3.2 LPS引起C57BL/6 小鼠肺中Cx40及VE-cadherin的表达随时间发生变化18-21
• 第二节 研究Cx40与肺血管通透性的关系21-27
• 1 实验材料21-22
• 1.1 实验仪器21
• 1.2 实验抗体及试剂21
• 1.3 主要工作液配制21-22
• 2 实验方法22-24
• 2.1 细胞培养22
• 2.2 离体肺灌注系统中使用PAF建立急性肺水肿模型22
• 2.3 PAF建立急性肺水肿模型中应用gap27~(40)及甘珀酸22-23
• 2.4 ECIS检测运用凝血酶建立内皮细胞屏障功能破坏模型和运用gap27~(40)及甘珀酸干预效果23
• 2.5 Cx40基因敲除C57BL/6 小鼠离体肺灌注23-24
• 3 结果24-27
• 讨论27-30
• 参考文献30-36
• 综述36-55
• 参考文献47-55
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文55-56
• 致谢56

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本文编号：390786