SARS-CoV刺突蛋白及其片段在细胞凋亡中的作用及凋亡机制的初步探讨

发布时间：2024-05-19 17:43

　　导致严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)的新型冠状病毒SARS-CoV可以诱导细胞凋亡。SARS-CoV Spike蛋白在介导病毒进入宿主细胞过程中发挥重要作用,对冠状病毒的包膜形成及对病毒的出芽和胞外分泌也是必要的。研究发现,作为SARS-CoV表面最重要的膜蛋白,SARS-CoV Spike蛋白可以诱导VeroE6细胞凋亡。目前,对SARS-CoV Spike蛋白诱导凋亡的机制研究甚少。MAPKs信号转导通路与病毒诱导凋亡的关系是近年来研究的热点之一。其中ERK1/2不仅与细胞增殖和分化密切相关而且参与细胞凋亡的调节。ERK1/2磷酸化下调导致了细胞生存信号的下降,进而导致了凋亡的发生。作为重要的细胞周期相关蛋白激酶途径,ERK1/2信号途径受到抑制是多种细胞凋亡的一个重要原因。ERK1/2, p38MAPK和JNK的动态平衡决定了细胞的存活或凋亡。 本研究证明,SARS-CoV Spike蛋白及其主要片段S318-510可以诱导VeroE6细胞凋亡。二者在早期可以通过抑制ERK1/2信号通路诱导VeroE6细胞的凋亡,...

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中文摘要
Abstract
英文略语表
前言
实验材料和方法
    1 实验材料
        1.1 质粒
        1.2 菌株
        1.3 工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker
        1.4 主要化学试剂
        1.5 细胞培养用耗材
        1.6 试剂盒
        1.7 主要仪器及设备
        1.8 主要溶液配方
            1.8.1 E.coli用培养基的配制
            1.8.2 制备感受态细胞相关溶液
            1.8.3 抗生素的配制
            1.8.4 大量提取质粒DNA的相关溶液
            1.8.5 DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制
            1.8.6 细胞冻存液的配制
            1.8.7 细胞裂解液的配制
            1.8.8 蛋白质电泳及检测缓冲液
            1.8.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制
            1.8.10 常用缓冲液的配制
        1.9 PCR引物
        1.10 抗体
        1.11 有关RNA提取以及Northern blotting溶液的配制
        1.12 慢病毒小量包装
    2 实验方法
        2.1 单链复性
        2.2 PCR扩增
        2.3 酶切消化
        2.4 连接
        2.5 转化
        2.6 鉴定
        2.7 感受态细胞的制备
        2.8 质粒DNA的小提
        2.9 质粒DNA的大量提取
        2.10 重组质粒DNA浓度的测定
        2.11 DNA的纯化回收
        2.12 贴壁细胞培养
        2.13 稳定表达细胞株的构建
        2.14 细胞冻存
        2.15 细胞复苏
        2.16 细胞裂解
        2.17 DNA ladder分析
        2.18 Annexin-V/PI双染流式分析测定早期细胞凋亡
        2.19 总RNA的提取及定量
            2.19.1 组织匀浆
            2.19.2 总RNA的抽提
            2.19.3 总RNA的沉淀
            2.19.4 总RNA的洗涤和溶解
            2.19.5 总RNA的检测
        2.20 Northern blotting实验
            2.20.1 探针的制备与纯化
            2.20.2 甲醛变性电泳凝胶制备
            2.20.3 样品处理
            2.20.4 转膜
            2.20.5 预杂交
            2.20.6 杂交
            2.20.7 洗膜
            2.20.8 信号检测
            2.20.9 探针去除及杂交参照基因Actin
        2.21 慢病毒包装实验
        2.22 病毒的收获及浓缩
        2.23 RNA干扰有效靶点筛选实验—RT-PCR筛靶
        2.24 Annexin V/PI双染
        2.25 Western Blotting的检测方法
        2.26 蛋白提纯
结果
    3.1 优化S蛋白,并合成S蛋白基因
    3.2 将CD5L插入载体,构建PEAK13 CD5L Fc质粒
    3.3 构建S及其片段基因的克隆,并检测
    3.4 瞬时转染P13 CD5L S1190 Fc,检测在VeroE6细胞中的蛋白表达
    3.5 SARS-CoV Spike蛋白引起细胞凋亡的形态改变
    3.6 FACS检测早期凋亡的细胞
    3.7 转染P13 CD5L S1190 Fc质粒诱导VeroE6细胞凋亡的DNA Ladder
    3.8 加入纯化的SARS-CoV 1190 Fc蛋白诱导VeroE6细胞凋亡
    3.9 转染P13 CD5L S1190 Fc质粒诱导HEK293细胞的PARP剪切实验
    3.10 SARS-CoV Spike蛋白的各个片段诱导凋亡的情况
        3.10.1 转染SARS-CoV S各不同片段质粒剪切PARP实验
        3.10.2 SARS-CoV S317 Fc不能诱导凋亡
        3.10.3 SARS-CoV S318-510蛋白可以诱导凋亡
            3.10.3.1 转染P13 CD5L S318-510 Fc质粒诱导的DNA Ladder
            3.10.3.2 加入SARS-CoV S318-510 Fc蛋白诱导的DNA Ladder
            3.10.3.3 FACS
        3.10.4 转染P13 CD5L S681-1190 Fc质粒可以诱导VeroE6细胞凋亡
    3.11 SARS-CoV Spike蛋白凋亡早期下调Bcl-2,上调Bax
    3.12 SARS-CoV Spike蛋白早期抑制ERK1/2信号通路
        3.12.1 转染P13 CD5L S1190 Fc质粒早期抑制ERK1/2信号通路
        3.12.2 加入纯化的SARS-CoV S1190 Fc蛋白诱导VeroE6细胞ERK1/2磷酸化信号的下调
    3.13 转染P13 CD5L S1190 Fc早期没有引起p38MAPK和JNK信号磷酸化水平的改变
    3.14 转染P13 CD5L S1190 Fc质粒早期引起凋亡相关的下游重要信号分子磷酸化的改变
    3.15 SARS-CoV S318-510蛋白也可以通过抑制ERK1/2信号通路诱导凋亡
    3.16 STAT3上游信号JAK1,JAK2,Tyk2磷酸化水平没有改变
    3.17 SARS-CoV Spike蛋白和SARS-CoV S318-510蛋白早期没有引起AKT信号改变
    3.18 SARS-CoV spike蛋白可以在蛋自及mRNA水平下调ACE2的表达
        3.18.1 SARS-CoV S1190 Fc蛋白引起受体ACE2下调实验
        3.18.2 Northern blotting检测野生型C57小鼠肺脏和肾脏中ACE2的表达
            3.18.2.1 小鼠肺脏和肾脏总RNA质量的检测
            3.18.2.2 检测小鼠肺脏和肾脏ACE2 mRNA表达水平
            3.18.2.3 SARS-CoV Spike蛋白下调VeroE6细胞ACE2 mRNA表达水平
    3.19 构建慢病毒感染的ACE2敲除的VeroE6永久细胞株(ACE2 RNAi VeroE6)
        3.19.1 目的基因RNA干扰慢病毒载体制备
        3.19.2 目的基因RNA干扰阳性克隆质粒抽提琼脂糖凝胶电泳图谱
        3.19.3 RT-PCR检测目的基因的mRNA表达水平
        3.19.4 构建慢病毒感染的ACE2 RNAi和NC RNAi的VeroE6永久细胞株
    3.20 检测SARS-CoV Spike蛋白在ACE2 RNAi VeroE6和Nc RNAi VeroE6细胞凋亡中的作用
        3.20.1 流式细胞仪PI单染法
        3.20.2 DNA ladder法检测细胞凋亡
讨论
小结
参考文献
论文综述
    参考文献
附录
致谢



本文编号：3978237