雷帕霉素诱导的细胞自噬在气道和肺部炎症中的作用研究

发布时间：2017-06-13 16:02

  本文关键词：雷帕霉素诱导的细胞自噬在气道和肺部炎症中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分细胞自噬在OVA诱导的小鼠气道炎症中的作用及其机制研究[研究背景]支气管哮喘(简称哮喘)是由多种炎症细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等共同参与的慢性气道炎症性疾病,其发病机制尚未完全明了。细胞自噬能降解细胞器和蛋白质,在维持细胞内环境的稳定中起着重要作用。目前研究发现细胞自噬与哮喘具有相关性,但是细胞自噬在哮喘中的作用及其具体的作用机制尚未完全明确,值得进一步探讨。[目的]建立OVA诱导的小鼠哮喘模型。观察哮喘模型中细胞自噬水平的变化,探讨细胞自噬在OVA诱导的小鼠哮喘模型中的作用和发挥作用的可能机制。[方法]健康雌性BALB/c小鼠,以卵白蛋白(OVA)致敏和激发建立小鼠哮喘模型。随机分为四组：生理盐水对照组(Control组)、哮喘组(OVA组)、雷帕霉素组(OVA+Rapa组)和氯喹组(OVA+CQ组)。雷帕霉素组(4mg/kg)和氯喹组(30mg/kg)在每次抗原激发前1小时进行腹腔注射。最后一次抗原激发后24小时内行肺组织HE染色和PAS染色分别观察气道炎症细胞浸润和粘液分泌；检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞分类计数；酶联免疫吸附实验(ELISA)检测BALF和血清中细胞因子IL-4, IL-13, TGF-β和IFN-y的表达；Real-time RT-PCR检测肺组织MUC5AC mRNA的表达；透射电镜观察小鼠气道上皮细胞内自噬体；Real-time RT-PCR检测自噬相关基因Atg5 mRNA和Atg7mRNA的表达；Western blot检测肺组织内自噬标志蛋白LC3(microtubule-associated protein light chain 3)的表达。雷帕霉素和氯喹分别预处理哮喘小鼠,检测自噬指标的变化,探讨细胞自噬发挥作用的可能机制。[结果]OVA诱导的小鼠肺组织病理见气道炎症细胞浸润和粘液分泌增多；BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞计数较对照组显著增加；BALF中IL-4,IL-13和TGF-β表达显著升高,IFN-y表达显著下降；血清中IL-4和IL-13表达显著升高；肺组织MUC5ACmRNA表达明显增加。雷帕霉素和氯喹预处理显著改善OVA诱导的气道炎症和粘液分泌。透射电镜观察OVA诱导的哮喘小鼠气道上皮细胞中自噬体增加；Atg5mRNA和Atg7mRNA表达增加；自噬标志蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化增加。雷帕霉素预处理后细胞自噬水平增加。氯喹能够抑制自噬溶酶体的降解,细胞内自噬体数量增加,细胞自噬水平增加。[结论]OVA诱导的小鼠哮喘模型中,气道炎症增加,雷帕霉素和氯喹可以缓解OVA诱导的气道炎症。OVA诱导细胞自噬水平增加,雷帕霉素和氯喹预处理后细胞自噬水平进一步增加。所以我们推测雷帕霉素和氯喹通过增加了OVA诱导的哮喘小鼠的细胞自噬而对哮喘发挥保护作用。我们的研究提示细胞自噬信号通路有望成为哮喘防治的靶点。第二部分细胞自噬在LPS诱导的急性肺损伤肺部炎症中的作用及其机制研究[研究背景]急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由多种病因诱发的肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤、氧合功能严重障碍,表现为弥漫性肺浸润和呼吸窘迫的综合症。其发病机制尚未完全明了。细胞自噬能降解细胞器和蛋白质,在维持细胞内环境的稳定中起着重要作用。目前研究发现细胞自噬与ALI具有相关性,但是细胞自噬在ALI中的作用及其具体的作用机制尚未完全明确,值得进一步探讨。[目的]建立脂多糖(LPS)诱发的小鼠急性肺损伤模型。观察急性肺损伤中细胞自噬水平的变化,探讨细胞自噬在肺损伤中的作用及发挥作用的可能机制。[方法]健康雄性C57BL/6小鼠,LPS经气管插管滴入建立小鼠急性肺损伤模型。随机分为四组：生理盐水对照组(Control组)、急性肺损伤组(LPS组)、雷帕霉素组(LPS+Rapa组)和乙酰半胱氨酸组(LPS+NAC组)。LPS气道滴入24h后观察肺组织病理;检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数、总蛋白浓度和肺组织MPO活力；酶联免疫吸附实验(ELISA)检测BALF中炎症因子TNF-α和IL-1β水平；检测肺组织氧化应激指标(H2O2、MDA、SOD和’TAOC);透射电镜观察自噬体；Western blot检测肺组织内自噬标志蛋白LC3及其信号通路蛋白的表达水平。雷帕霉素预处理肺损伤小鼠,检测自噬指标的变化,探讨细胞自噬发挥作用的可能机制。[结果]LPS诱导小鼠肺组织HE染色表现为广泛的炎症细胞浸润,肺泡毛细血管屏障受损,肺泡间隔增宽,肺泡和肺间质充血、水肿；BALF中细胞总数、总蛋白浓度和肺组织MPO活力增加；TNF-α和1L-1β的表达均明显升高；氧化应激指标增强(H2O2和MDA增加,SOD活力降低)；透射电镜提示ALI时细胞自噬增强；Western blot显示LPS诱导肺组织内LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化增加,mTOR及P70S6磷酸化增强。雷帕霉素预处理增强细胞自噬水平,减轻肺部炎症。[结论]雷帕霉素可以降低LPS诱导的ALI的气道炎症和氧化应激,发挥保护作用。LPS诱导ALI时细胞自噬水平增加,雷帕霉素预处理后,细胞自噬水平进一步增加。ALI时mTOR及其主要下游蛋白P70S6活化,雷帕霉素有抑制其活化作用。我们推测雷帕霉素是通过mTOR信号通路增加LPS诱导的细胞自噬,降低了LPS诱导的炎症反应和氧化应激,从而发挥对ALI的保护作用。
【关键词】：细胞自噬 支气管哮喘 雷帕霉素 氯喹 气道炎症 细胞自噬 雷帕霉素 细菌脂多糖 急性肺损伤
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R56
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写索引11-12
• 引言12-15
• 第一部分 细胞自噬在OVA诱导的小鼠气道炎症中的作用及其机制研究15-40
• 前言15
• 材料与方法15-28
• 结果28-37
• 讨论37-40
• 第二部分 细胞自噬在LPS诱导的急性肺损伤肺部炎症中的作用及其机制研究40-59
• 前言40
• 材料与方法40-47
• 结果47-56
• 讨论56-59
• 全文小结59-60
• 参考文献60-64
• 综述一64-75
• 参考文献72-75
• 综述二75-81
• 参考文献78-81
• 在读期间发表文章及会议摘要81-82
• 致谢82-83

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本文编号：446926