肺脏来源的exosome参与肺脏免疫平衡维持的功能及其机制研究

发布时间：2017-08-06 23:03

  本文关键词：肺脏来源的exosome参与肺脏免疫平衡维持的功能及其机制研究

  更多相关文章： 肺脏免疫耐受 Exosome TGF-β1 哮喘

【摘要】：人体每天经呼吸道吸入大量外界环境中的抗原性物质,而进入呼吸道系统中的各种外界环境抗原均有可能诱发机体免疫系统产生强烈的排异反应。然而正常情况下,呼吸道却始终能够处于一种相对的免疫平衡状态,说明肺脏可以通过某些精细调节诱导对外来抗原的免疫耐受,从而维持肺脏的相对免疫平衡状态。随着人类长期的进化,我们的免疫系统逐渐形成了几种有效的方式维持机体对一些外来无害抗原的免疫耐受,包括克隆失能、克隆忽略和通过调节性T细胞分泌IL-10及TGF-β1等抑制性细胞因子防止免疫效应细胞的活化等。而一旦肺脏免疫耐受平衡被打破会导致呼吸道相关的自身免疫性疾病,比如哮喘。哮喘是最常见的呼吸道免疫失衡性疾病之一,目前认为Th1/Th2细胞之间平衡的紊乱是哮喘最主要的发病机制,免疫失衡是哮喘重要的发病基础,而对呼吸道免疫耐受形成机制的深入研究也可以为哮喘的治疗提供新的思路。Exosome是各种活细胞分泌的具有脂质双分子层结构的小囊泡,其直径主要介于30-100 nm之间,密度范围从1.12g/ml到1.21 g/ml。目前已经有很多文献证实, exosome在促进免疫反应和抑制免疫反应中扮演着重要作用,本课题中exosome的来源为小鼠肺脏组织,我们探讨肺脏组织来源的exosome是否参与了肺脏免疫耐受的维持,通过建立哮喘动物模型来验证我们的这一猜想,从而为呼吸道免疫耐受失衡相关疾病提供新的思路。首先我们对肺脏来源的exosome (exosome from lung, L-EXO)进行鉴定,电镜结果表明我们提取的L-EXO直径一般在30-100 nm之间,通过密度梯度离心密度范围为1.09 g/ml到1.17 g/ml之间,且表达CD63、TSG101和HSP70等exosome标志性蛋白,而不表达质膜相关蛋白GRP94。此外,L-EXO还表达免疫抑制分子TGF-β1和IL-10。我们发现L-EXO能在体外明显抑制CD4+T细胞的增殖,并诱导Treg的产生,采用TGF-β1受体阻断我们发现L-EXO对CD4+T细胞增殖抑制的能力几乎消失了,说明L-EXO具有免疫抑制功能依赖于TGF-β1。接着,我们探讨了L-EXO的具体来源细胞。L-EXO表面表达CD8、CDllc和SPB (surfactant protein B),采用磁珠分选的方法分选出CDllc阳性和CD8阳性的L-EXO,我们发现分选的CDllc阳性的L-EXO同时表达CD8；反之亦然。而且只有该群L-EXO具有抑制CD4+T细胞的增殖的能力,说明具有免疫抑制功能的L-EXO是来源于CD8阳性的树突状细胞(dendritic cells, DCs)。体内实验部分我们采用OVA诱导的小鼠急性哮喘模型,探讨我们分离出来的L-EXO是否参与肺脏免疫耐受的维持,通过尾静脉回输L-EXO后分析肺泡灌洗液的细胞成分、各种细胞因子和肺脏病理变化,我们发现L-EXO对哮喘症状有一定的缓解效应,根据之前的分选L-EXO亚群的结果我们分选出CD11c+ L-EXO回输小鼠体内发现对哮喘的缓解效果更好,所以体内体外结果均提示我们L-EXO对哮喘的症状有一定程度的缓解。接下来我们想知道L-EXO对哮喘的缓解作用是否依赖于TGF-β1。体内实验结果表明回输正常小鼠L-EXO后,Smad3+/.小鼠哮喘缓解效果较对照野生型C57小鼠差,但L-EXO对Smad3+/.小鼠的哮喘仍具有一定的缓解作用。鉴于,我们在L-EXO中同时还发现较高水平的IL-10。因此,我们进一步评价L-EXO携带的IL-10是否参与其对小鼠哮喘的缓解作用。我们分选了IL-10-/-小鼠的L-EXO回输给C57小鼠,虽然具有缓解哮喘的效果,但与正常小鼠来源的L-EXO相比,其作用要明显削弱,这些实验数据提示L-EXO依赖于TGF-β1和IL-10维持呼吸道的免疫耐受。为进一步明确L-EXO在维持呼吸道免疫耐受中的作用,我们采用中性鞘磷脂酶小干扰RNA敲低3LL肺癌细胞中Smpd3的表达,并证实了当Smpd3的表达被被抑制之后,可明显抑制exosome的分泌。之后,体内也验证了当给予小鼠鼻饲滴入Smpd3干扰慢病毒后小鼠肺脏分泌exosome的量减少,同时我们可以观察到,OVA诱导的小鼠急性哮喘症状明显加强,而外源性回输L-EXO后小鼠的哮喘症状可以得到缓解,表明L-EXO参与了呼吸道免疫耐受的维持。综上,在本课题的研究中,我们发现L-EXO具有免疫抑制功能,能够通过其携带的TGF-p11和IL-10缓解OVA诱导的小鼠急性哮喘,而生理存在的L-EXO对老鼠哮喘的症状具有重要的影响。我们的研究结果为解释肺脏免疫耐受提供了一种新的机制,同时也提示我们可以通过增加L-EXO的分泌治疗哮喘等呼吸道系统免疫失衡相关疾病。
【关键词】：肺脏免疫耐受 Exosome TGF-β1 哮喘
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 致谢4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-14
• 1 引言14-16
• 2 材料与方法16-24
• 2.1 实验材料16-18
• 2.2 实验方法18-24
• 3 实验结果24-54
• 3.1 小鼠肺脏能够分泌exosome24-27
• 3.2 肺来源的exosome具有抑制CD4~+T细胞增殖的功能27-34
• 3.3 L-EXO通过TGF-β1缓解OVA诱导的小鼠哮喘的症状34-45
• 3.4 L-EXO通过IL-10缓解OVA诱导的小鼠哮喘的症状45-47
• 3.5 抑制体内exosome的分泌会增加小鼠对OVA诱导的急性哮喘的易感性47-54
• 4 结论54-55
• 参考文献55-56
• 综述56-78
• 参考文献65-78
• 作者简历78

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本文编号：631778