表达Ag85A-IL-17A重组耻垢分枝杆菌构建及抗气道炎症反应机制

发布时间：2017-08-09 03:22

  本文关键词：表达Ag85A-IL-17A重组耻垢分枝杆菌构建及抗气道炎症反应机制

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【摘要】：气道炎症反应是多种呼吸系统疾病的共同病理特征,主要包括感染性气道炎症反应和过敏性气道炎症反应。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是呼吸系统最常见的感染病原体,其感染后气道炎症反应以中性粒细胞浸润为主。哮喘则是以气道炎性细胞浸润、气道高反应性和气道黏液分泌增加等为特征的过敏性疾病,中性粒细胞在其病理过程中也发挥重要作用。目前研究发现,Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17A、IL-17F等在以中性粒细胞浸润为特征的气道炎症反应中发挥关键作用。因此,拮抗IL-17A和IL-17F的功能成为抑制气道炎症反应的重要途径。我们对IL-17A和IL-17F与肺炎链球菌感染所致气道炎症反应的关系进行了实验研究,并在此基础上进一步研究IL-17A和IL-17F与过敏性气道炎症反应的相互关系。根据Lanre Delavallée的理论,当自身蛋白与外源性蛋白结合,通过外源性蛋白提供Th细胞抗原表位,可激活T-B细胞反应,活化B细胞,产生抗自身蛋白的抗体。因此,我们设想若在体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F的自身抗体,抑制IL-17A和IL-17F的功能,可望有效减轻气道炎症反应。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)无致病性,且具有免疫调节功能,是基因工程疫苗的常用载体。Ag85A是卡介苗(BCG)免疫原性较强的分泌蛋白复合体Ag85的组分之一,能够促进Th1型免疫反应。本实验拟构建重组耻垢分枝杆菌疫苗,以Ag85A为外源性蛋白提供Th细胞抗原表位,在小鼠体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F自身抗体,研究其抗气道炎症反应的相关机制。目的:构建表达Ag85A-IL-17A/F重组耻垢分枝杆菌r MS-Ag85a-IL-17a/f,体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F自身抗体,并探讨其抗气道炎症反应相关机制。方法:本实验拟分三步进行:(1)r MS-Ag85a-IL-17a/f的构建及体内诱导自身抗体产生:利用分子克隆技术,将Ag85a-IL-17a/f基因片段克隆至穿梭表达载体p MFA42S中,构建获得重组质粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a/f,并电转化至耻垢分枝杆菌中,获得r MS-Ag85a-IL-17a/f。经Western blot鉴定蛋白表达。以重组耻垢分枝杆菌鼻腔黏膜免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清中抗IL-17A和IL-17F自身抗体的滴度以及肺组织匀浆中IL-5、IL-12和IL-17A等细胞因子的浓度;RT-PCR法检测肺组织中转录因子T-bet和GATA3的m RNA表达情况。HE染色观察小鼠肺组织病理改变。(2)r MS-Ag85a-IL-17a的体外功能研究:r MS-Ag85a-IL-17a体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,以MS为对照组,观察r MS-Ag85a-IL-17a对巨噬细胞凋亡、吞噬功能的影响,Griess法检测细胞培养上清中NO的分泌情况,ELISA法检测细胞培养上清中IL-6、MIP-1α、TNF-α、IL-10的分泌水平,RT-PCR法检测细胞内IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的m RNA表达情况。(3)r MS-Ag85a-IL-17a抗哮喘小鼠气道炎症反应机制的研究:构建小鼠哮喘模型,以r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫干预。实验动物分为PBS组,哮喘组,重症哮喘组,重症哮喘+MS组和重症哮喘+r MS-Ag85a-IL-17a组。瑞吉染色计数小鼠肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及细胞分类计数,并测定BALF中髓过氧化物酶(MPO)活力,HE及PAS染色观察小鼠肺组织病理改变,ELISA法测定BALF及脾细胞培养上清中细胞因子IL-5、IL-6、IL-12、IL-10、IL-13和IL-17A的浓度,流式细胞术检测脾脏INF-γ+Th1细胞及IL-4+Th2细胞的含量,RT-PCR法检测肺组织中IL-6、IL-10、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β、T-bet、GATA3和RORγt的m RNA表达情况。结果:(1)重组质粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a经测序及酶切鉴定正确,质粒电转化耻垢分枝杆菌获得r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot鉴定其表达融合蛋白Ag85A-IL-17A,该融合蛋白与抗IL-17A抗体特异性结合。r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫小鼠,可诱导产生抗IL-17A自身抗体,免疫后第1周血清中开始出现自身抗体,第3周到达峰值,有效滴度可维持4周以上。r MS-Ag85a-IL-17a降低小鼠肺组织匀浆中IL-5和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;上调肺组织T-bet的表达。r MS-Ag85a-IL-17f未能在小鼠体能诱导产生抗IL-17F自身抗体。r IL-17F能够增强小鼠肺部炎症反应,减少肺炎链球菌在小鼠肺部的定植。(2)r MS-Ag85a-IL-17a增强巨噬细胞的吞噬功能,促进巨噬细胞的凋亡;提高巨噬细胞分泌NO、IL-6、MIP-1α及TNF-α的水平,促进细胞内IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的表达。(3)r MS-Ag85a-IL-17a干预哮喘小鼠模型,与重症哮喘组比较,r MS-Ag85a-IL-17a显著降低哮喘小鼠BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞的数量;降低BALF中IL-5、IL-6、IL-13和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;降低脾细胞培养上清中IL-5、IL-6、IL-13和IL-17A的水平,提高IL-12、IL-10的水平;抑制BALF中MPO的活力;抑制肺组织IL-6、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β和GATA3的表达,上调IL-10和T-bet的表达;流式细胞术结果提示r MS-Ag85a-IL-17a提高小鼠脾脏INF-γ+Th1细胞数量,降低IL-4+Th2细胞数量;肺组织病理结果提示r MS-Ag85a-IL-17a干预组小鼠的气道炎症明显减轻,炎性细胞渗出及气道黏液分泌减少。结论:(1)成功构建重组耻垢分枝杆菌r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot证实其表达融合蛋白Ag85A-IL-17A。r MS-Ag85a-IL-17a能够在小鼠体内诱导产生较高滴度的抗IL-17A自身抗体。(2)r MS-Ag85a-IL-17a加强巨噬细胞吞噬功能,促进细胞分泌炎症介质,增强巨噬细胞抗感染能力。(3)r MS-Ag85a-IL-17a经鼻腔黏膜免疫能够有效减轻小鼠气道炎症反应。
【关键词】：重组耻垢分枝杆菌 白介素-17A 自身抗体 气道炎症反应
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 缩略词16-19
• 前言19-28
• 参考文献23-28
• 第一章 重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a/f构建及体内诱导自身抗体产生28-71
• 实验一 重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a构建及体内诱导自身抗体产生30-58
• 1 材料30-32
• 1.1 菌株、质粒、培养基30-31
• 1.2 酶、抗体、化学试剂、抗生素及试剂盒31
• 1.3 荧光定量PCR检测用引物31-32
• 1.4 实验动物32
• 1.5 主要实验仪器32
• 2 方法32-48
• 2.1 重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a构建及鉴定32-39
• 2.2 表达Ag85A-IL-17A的重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及鉴定39-42
• 2.3 重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a小鼠体内诱导抗IL-17A自身抗体42-48
• 2.4 统计学分析48
• 3 结果48-58
• 3.1 重组质粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a的构建及鉴定48-50
• 3.2 重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a的鉴定50-51
• 3.3 重组耻垢分枝杆菌与野生型耻垢分枝杆菌生长曲线的比较51-52
• 3.4 Western blot鉴定Ag85A-IL-17A在重组耻垢分枝杆菌中的表达52
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜接种后对小鼠体重的影响52-53
• 3.6 rMS-Ag85a-IL-17a小鼠体内诱导产生抗IL-17A自身抗体53-54
• 3.7 小鼠肺组织匀浆中耻垢分枝杆菌CFU的变化54-55
• 3.8 rMS-Ag85a-IL-17a对小鼠肺组织匀浆中IL-5，IL-12，IL-17A表达水平的影响55
• 3.9 rMS-Ag85a-IL-17a对小鼠肺组织T-bet，GATA3 m RNA表达的影响55-56
• 3.10 rMS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜接种后小鼠肺组织病理的改变56-58
• 实验二 重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17f的构建及相关功能研究58-66
• 1 材料58-59
• 1.1 菌株、质粒、培养基58-59
• 1.2 实验动物59
• 1.3 化学试剂及试剂盒59
• 1.4 主要实验仪器59
• 2 方法59-60
• 2.1 实验动物分组59-60
• 2.2 肺泡灌洗液（BALF）的收集60
• 2.3 BALF中肺炎链球菌培养及计数60
• 2.4 统计学分析60
• 3 结果60-62
• 3.1 小鼠BALF菌落计数60-61
• 3.2 rIL-17F对小鼠BALF细胞分类计数的影响61-62
• 4 讨论62-66
• 参考文献66-71
• 第二章 重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a对小鼠巨噬细胞RAW264.7 功能的影响71-89
• 1 材料71-73
• 1.1 细胞系、菌株及培养基71-72
• 1.2 试剂盒及主要化学试剂72
• 1.3 荧光定量PCR检测用引物72-73
• 1.4 主要实验仪器73
• 2 方法73-78
• 2.1 MS及rMS-Ag85a-IL-17a菌株准备及RAW264.7 细胞培养73-74
• 2.2 MS及rMS-Ag85a-IL-17a感染RAW264.7 细胞74-75
• 2.3 细胞培养上清NO浓度测定（Griess法）75-76
• 2.4 ELISA法测定细胞培养上清中细胞因子IL-6，IL-10，TNF-α及MIP-1α浓度76-77
• 2.5 实时荧光定量PCR法检测细胞中IL-6，IL-10，Defb-2 及i NOS的表达77-78
• 2.6 统计学分析78
• 3 结果78-83
• 3.1 巨噬细胞内CFU的比较78-79
• 3.2 rMS-Ag85a-IL-17a对巨噬细胞凋亡率的影响79-80
• 3.3 rMS-Ag85a-IL-17a对巨噬细胞分泌NO的影响80-81
• 3.4 rMS-Ag85a-IL-17a对巨噬细胞培养上清中IL-6，IL-10，MIP-1α 及TNF-α 表达的影响81-82
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a对巨噬细胞IL-6，IL-10，Defb-2 及i NOS m RNA表达的影响82-83
• 4 讨论83-85
• 参考文献85-89
• 第三章 重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a抗过敏性气道炎症机制研究89-123
• 1 材料89-92
• 1.1 实验动物89-90
• 1.2 菌株及培养基90
• 1.3 试剂盒、抗生素及主要化学试剂90-91
• 1.4 荧光定量PCR检测用引物91
• 1.5 主要实验仪器91-92
• 2 方法92-101
• 2.1 菌株及实验动物准备92
• 2.2 动物免疫方案92-94
• 2.3 标本采集及处理94-97
• 2.4 实验指标测定97-99
• 2.5 肺组织病理学分析99-101
• 2.6 统计学分析101
• 3 结果101-117
• 3.1 小鼠血清中抗IL-17A自身抗体的滴度变化101-102
• 3.2 rMS-Ag85a-IL-17a对哮喘小鼠BALF中炎性细胞的影响102-104
• 3.3 rMS-Ag85a-IL-17a对哮喘小鼠BALF中细胞因子IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，IL-13 及IL-17A表达的影响104-106
• 3.4 rMS-Ag85a-IL-17a对哮喘小鼠脾细胞培养上清中细胞因子表达的影响106-108
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a对小鼠BALF中髓过氧化物酶活力的影响108-109
• 3.6 rMS-Ag85a-IL-17a对小鼠肺组织IL-6，IL-10，IL-23，，Eotaxin-1，MIP-2，TGF-β，T-bet，GATA3和RORγt m RNA表达的影响109-110
• 3.7 rMS-Ag85a-IL-17a对小鼠脾细胞增殖的影响110-111
• 3.8 rMS-Ag85a-IL-17a对哮喘小鼠脾脏Th1和Th2细胞数量的影响111-114
• 3.9 rMS-Ag85a-IL-17a黏膜免疫后小鼠肺组织病理改变114-117
• 4 讨论117-120
• 参考文献120-123
• 第四章 全文总结123-125
• 1 研究内容总结123
• 2 研究的创新点123-124
• 3 研究的意义及展望124-125
• 附录：实验室常规培养基及主要试剂配方125-128
• 致谢128-129
• 攻读博士期间发表学术论文及参加科学研究项目情况129

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1 徐苗,陈保文,沈小兵,苏城,罗永艾,王国治;耻垢分枝杆菌作为免疫调节剂的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年09期

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本文编号：643321