人羊膜间充质干细胞静脉移植对哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响

发布时间：2017-08-11 06:16

  本文关键词：人羊膜间充质干细胞静脉移植对哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响

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【摘要】：第一部分哮喘小鼠动物模型的制备目的:鸡卵清白蛋白(OVA)腹腔联合皮下注射致敏和雾化激发小鼠,制备哮喘模型。方法:将BALB/c雌性小鼠随机分为哮喘组(AS)和生理盐水对照组(NS),每组7只。两组小鼠于第1、13天分别以OVA和生理盐水腹腔联合皮下注射致敏,第19d分别予10%OVA溶液、生理盐水连续雾化激发5d,末次激发24h后处死小鼠。测定小鼠BALF细胞总数和细胞分类计数,采用ELISA检测BALF的IL-5、IL-12、IL-17水平,HE染色观察肺组织病理学改变,AB-PAS染色观察气道上皮杯状细胞和黏液物质改变,VG染色观察气道周围胶原纤维沉积,免疫组化染色和实时定量PCR检测肺组织Muc5ac蛋白和m RNA表达水平。结果:AS组小鼠BALF细胞总数、细胞分类计数、IL-5、IL-17表达水平、气道炎症细胞浸润评分、气道壁厚度、气道上皮杯状细胞及黏液物质阳性相对着色面积、气道周围胶原纤维阳性相对着色面积、Muc5ac蛋白及m RNA表达均高于NS组,差异有统计学意义(P0.01)。IL-12表达水平低于NS组,差异有统计学意义(P0.01)。结论:以OVA腹腔联合皮下注射致敏和雾化吸入激发可成功复制小鼠哮喘模型。第二部分人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定目的:从人羊膜组织中分离、纯化及鉴定间充质干细胞。方法:收集健康足月剖宫产产妇新鲜胎盘,采用机械联合胰蛋白酶-胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞(h AMSCs),通过贴壁、酶消化法进行传代培养,观察P1~P3代细胞形态,传至第三代的h AMSCs,采用流式细胞术(FCM)鉴定细胞表型特征。结果:h AMSCs呈典型贴壁生长,纤维状,长梭形。第3代h AMSCs高表达CD90,CD105,CD44,CD73,几乎不表达CD34,CD11b,CD19,CD45和HLA-DR。结论:从体外成功分离培养出人羊膜间充质干细胞。第三部分人羊膜间充质干细胞静脉移植对哮喘小鼠气道的影响目的:观察人羊膜间充质干细胞静脉移植对哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响。方法:将35只雌性BALB/c小鼠按随机数字法分为NS组、AS组、人羊膜间充质干细胞干预组(AS+h AMSCs)、人羊膜间充质干细胞自身对照组(NS+h AMSCs)、地塞米松干预组(AS+DEX),每组7只。AS组和NS组处理同第一部分。AS+h AMSCs组在第1次致敏后第18d通过尾静脉注射Brdu标记的第3代h AMSCs悬液(1×106)0.25ml/只,余处理同AS组;NS+h AMSCs组第18d经尾静脉注射Brdu标记的第3代h AMSCs悬液(1×106)0.25ml/只,余处理同NS组;AS+DEX组于每日雾化激发前30min,予地塞米松2mg/kg腹腔注射,余处理同AS组;检测各组小鼠BALF细胞总数和细胞分类计数,ELISA测定IL-5、IL-12、IL-17水平变化,免疫荧光染色观察h AMSCs经Brdu标记率及h AMSCs在体内定植情况;HE,AB-PAS,VG,免疫组化染色和实时定量PCR检测指标同第一部分。结果:免疫荧光染色在两组小鼠体内均可检测到h AMSCs的定植,以AS+h AMSCs组肺组织细胞定植明显。AS+h AMSCs组BALF细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比、IL-5、IL-17水平、气道周围炎症细胞浸润评分、气道壁厚度、气道周围胶原纤维沉积面积、气道上皮杯状细胞和黏液物质阳性相对着色面积、肺组织Muc5ac蛋白及Muc5ac m RNA表达水平均较AS组降低,差异有统计学意义(P0.01);较NS组增高,差异有统计学意义(P0.01)。IL-12表达水平较AS组升高,较NS组降低,差异有统计学意义(P0.01)。NS+h AMSCs组与NS组比较,各指标差异无统计学意义(P0.05)。结论:1.h AMSCs静脉移植能归巢至小鼠肺组织,以哮喘组明显。2.h AMSCs干预可减轻哮喘气道炎症及气道重塑,其机制可能是通过抑制IL-5、IL-17的表达促进IL-12表达而调节Th1/Th2平衡及抑制Th17细胞功能及修复受损细胞。
【关键词】：OVA 哮喘 小鼠 动物模型 哮喘 人羊膜间充质干细胞 Muc5ac Th1/Th2 IL-17 羊膜间充质干细胞 h AMSCs 流式细胞术
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 中英缩略词对照表5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 第一部分 哮喘小鼠模型的制备15-48
• 1.材料与方法15-27
• 2.结果27-41
• 3.讨论41-44
• 4.结论44-45
• 参考文献45-48
• 第二部分 人羊膜间充质干细胞原代、传代培养及鉴定48-59
• 1.材料与方法48-52
• 2.结果52-55
• 3.讨论55-57
• 4.结论57-58
• 参考文献58-59
• 第三部分 人羊膜间充质干细胞静脉移植对哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响59-83
• 1.材料与方法59-63
• 2.结果63-75
• 3.讨论75-79
• 4.结论79-80
• 参考文献80-83
• 附图83-87
• 综述87-97
• 参考文献92-97
• 致谢97-99
• 作者简介99

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本文编号：654587