拴链因子Exocyst与皮层肌动结合蛋白Cortactin在黏液高分泌中的耦联效应

发布时间：2017-08-17 17:06

  本文关键词：拴链因子Exocyst与皮层肌动结合蛋白Cortactin在黏液高分泌中的耦联效应

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【摘要】：目的明确COPD患者和正常人群支气管上皮和人支气管上皮细胞16HBE细胞株中Exocyst复合物的定位和表达情况。构建离体黏液高分泌细胞模型，探讨拴链因子Exocyst复合物在中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）介导的气道粘蛋白5AC（MUC5AC）高分泌中的调控作用。并就拴链复合物Exocyst和皮层肌动结合蛋白Cortactin在该过程中的耦联作用进行初步探讨。 方法 (1)目标人群和人支气管上皮16HBE细胞株中Sec3的定位和表达情况 免疫组织化学法检测目标人群支气管上皮中Sec3蛋白的分布特征，细胞免疫荧光法检测NE前后16HBE细胞株中Sec3蛋白的胞内分布情况，real-time PCR和western blotting法分别检测目标人群气管上皮和16HBE细胞株中Sec3mRNA和蛋白的差异性表达。 (2)拴链因子Exocyst复合物的促黏液分泌效应 构建两条Sec3-shRNA并稳转16HBE细胞株，real-time PCR法和western blotting法检测Sec3特异性shRNA的沉默效率。给予最适NE浓度和时长刺激16HBE细胞，real-time PCR法和ELISA法观察各组细胞MUC5AC mRNA和蛋白的表达量，明确Sec3亚基在促黏液分泌过程中的调控作用。 (3)拴链因子Exocyst和皮层肌动结合蛋白Cortactin的促黏液分泌耦联效应 分别构建Cortactin-shRNA和Sec3-shRNA的单独转染和共转染细胞株，real-time PCR法和western blotting法检测Cortactin-shRNA的沉默效率。Real-time PCR法和ELISA法观察各组细胞MUC5ACmRNA和蛋白的表达量，免疫共沉淀技术和细胞免疫荧光双标技术检测细胞内Sec3和Cortactin的相互作用和共定位，明确Sec3和Cortactin在促黏液分泌过程中的耦联效应。 结果 (1)目标人群和人支气管16HBE细胞株Sec3的表达情况 COPD患者和正常人群支气管上皮细胞均表达有Sec3，均富集于靠管腔面细胞顶端，且COPD患者中Sec3表达明显高于正常人群。人支气管上皮16HBE细胞中表达有Sec3，并主要定位于胞浆中。当给予NE刺激时，细胞中Sec3呈高表达状态，并由胞浆转移至胞膜。 (2)拴链因子Exocyst复合物的促黏液分泌效应 成功构建了两条特异性Sec3-shRNA，其中Sec3-shRNA1具备较理想的沉默效率。NE可促进MUC5AC mRNA和蛋白的表达增高，并呈剂量依赖性和时间依赖性增加。Sec3-shRNA可显著阻断NE诱导的MUC5AC蛋白胞内高合成和胞外高分泌，但对MUC5AC mRNA高表达的抑制作用并不明显。 (3)拴链因子Exocyst和皮层肌动结合蛋白Cortactin的促黏液分泌耦联效应 Cortactin-shRNA可明显抑制NE诱导的MUC5AC胞内高表达和胞外高分泌，但对MUC5AC mRNA的高表达抑制作用不明显。并且在联合Cortactin-shRNA和Sec3-shRNA的双重沉默作用情况下，不仅可明显抑制NE诱导的MUC5AC胞内合成，更可完全阻断NE诱导的MUC5AC胞外分泌。免疫共沉淀发现Sec3和Cortactin具有相互作用，在NE刺激时该相互作用明显加强。细胞免疫荧光双标发现明显的重叠信号，具有明显的共定位。 结论 (1) COPD患者支气管上皮中Sec3呈高表达状态，，并富集于靠管腔面细胞顶端； (2) NE可诱导16HBE细胞Sec3的高表达，并促其由胞浆向胞膜转移； (3) NE可呈浓度依赖性和时间依赖性诱导MUC5AC基因和蛋白的高表达； (4) Sec3介导了NE诱导的MUC5AC蛋白胞内高合成和胞外高分泌； (5) Sec3和Cortactin具有耦联促黏液分泌效应，并基本掌控了MUC5AC的胞外分泌过程。
【关键词】：气道黏液高分泌 粘蛋白5AC 中性粒细胞弹性蛋白酶 Sec3/Exocyst拴链复合物 皮层肌动结合蛋白Cortactin
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.9
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-20
• 参考文献18-20
• 第一部分 人支气管上皮和上皮细胞系拴链因子 Exocyst 的表达情况20-40
• 1 材料与方法20-31
• 2 结果31-35
• 3 讨论35-38
• 参考文献38-40
• 第二部分 拴链因子 Exocyst 对支气管上皮细胞黏液高分泌行为的影响40-63
• 第一章 Sec3-shRNA 重组质粒的构建40-51
• 1 材料与方法40-47
• 2 结果47-51
• 第二章 Sec3 对气道粘蛋白高分泌的调控作用51-59
• 1 材料与方法51-54
• 2. 结果54-59
• 讨论59-61
• 参考文献61-63
• 第三部分 拴链因子 Exocyst 与皮层肌动结合蛋白 Cortactin 在黏液高分泌中的耦联效应63-74
• 1 材料与方法63-65
• 2 结果65-70
• 3 讨论70-72
• 参考文献72-74
• 全文总结74-75
• 文献综述75-87
• 参考文献83-87
• 致谢87-88
• 攻读博士学位期间发表的论文目录88-89

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1 刘春漪;拴链因子Exocyst与皮层肌动结合蛋白Cortactin在黏液高分泌中的耦联效应[D];重庆医科大学;2014年

本文编号：690131