H5N1型禽流感病毒和纳米材料引起急性肺损伤的机制研究和防治药物筛选

发布时间：2017-08-18 13:09

  本文关键词：H5N1型禽流感病毒和纳米材料引起急性肺损伤的机制研究和防治药物筛选

  更多相关文章： H5N1型禽流感病毒 急性肺损伤 Ang Ⅱ 氯沙坦 氯喹 氧化铜纳米颗粒 自噬

【摘要】：H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤的致病机理研究和防治药物筛选自2003年发现H5N1型高致病性禽流感病毒能够感染人体以来,经WHO统计,截至目前全世界范围内共有784人感染H5N1病毒,其中429人死亡,整体死亡率高达54.7%。加之相关研究报道已证实,H5N1病毒仅需在HA蛋白和PB2蛋白上的数个氨基酸突变即可通过空气在雪貂之间传播。面对H5N1病毒居高不下的死亡率和为数不多的可供选择的药物,我们将研究重点集中于H5N1型禽流感病毒的致病机理解析和发现新的可用于治疗H5N1病毒感染的药物和方法。我们的前期研究发现了肾素-血管紧张素系统在H5N1病毒感染导致的急性肺损伤中发挥重要功能,RAS效应分子AngⅡ被上调且介导急性肺损伤,而AngⅡ负向调控蛋白ACE2则具有保护功能,且可通过预防联合治疗性给药缓解小鼠急性肺损伤症状并挽救小鼠死亡。在本项目中,我们进一步发现,H5N1型高致病性禽流感病毒感染人体后同样会引起AngⅡ的显著上调,并通过检测H5N1病毒感染后连续时间点AngⅡ表达水平证明,其整体表达水平,变化趋势和最终浓度可能作为反应H5N1病毒感染患者最终是否致死的重要指标之一。而ACE2蛋白的保护机制则可能包括降低AngⅡ的表达,抑制病毒复制并降低病毒载量等。进一步,根据老药新用的理念,我们对一系列临床使用药物在H5N1病毒感染动物模型上进行了治疗效果的尝试,发现临床抗疟疾药物氯喹和临床降压药氯沙坦可分别通过不同的机制来缓解H5N1病毒引起的急性肺损伤症状,但ACEi类药物和他汀类药物经检测后并不具有明显的治疗效果。上述研究提供了多种可用于治疗H5N1病毒感染的临床候选药物。氧化铜纳米颗粒可引起A549细胞自噬性细胞死亡金属氧化物纳米颗粒已被用于酶催化,环境检测和个人护理产品等多个领域,是目前应用最广泛的一类纳米颗粒。我们之前对部分常见的金属氧化物纳米颗粒如二氧化硅,二氧化钛,氧化铜,四氧化三铁等对呼吸道细胞毒性研究发现,仅氧化铜纳米颗粒可引起呼吸道细胞显著的细胞死亡。在本课题中,我们又进一步地对氧化铜纳米颗粒引起细胞死亡的种类和机制进行探索,通过电镜观察自噬小泡,confocal观察LC3蛋白聚集的细胞数量及加入巴佛洛霉素A1药物观察自噬潮等指标,我们发现其能够引起细胞产生严重的自噬现象,进一步通过siRNA或自噬抑制剂进行作用后,氧化铜纳米颗粒引起的细胞死亡得到显著缓解,证明氧化铜纳米颗粒可以引起呼吸道细胞的自噬性死亡。
【关键词】：H5N1型禽流感病毒 急性肺损伤 Ang Ⅱ 氯沙坦 氯喹 氧化铜纳米颗粒 自噬
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563
【目录】：

• 中文摘要13-15
• Abstract15-18
• 英文略语表18-20
• 序言20-21
• 第一部分 H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤机理的研究和临床防治药物的筛选21-89
• 第一节 RAS系统在H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤过程中的研究22-58
• 前言22-25
• 1. 实验材料25-26
• 1.1. 实验动物25
• 1.2. 实验试剂25
• 1.2.1. 试剂盒25
• 1.2.2. 细胞株25
• 1.2.3. 病毒株25
• 1.2.4. H5N1禽流感病毒蛋白表达质粒25
• 1.3. 主要生化试剂和抗体25-26
• 1.4. 细胞培养及转染试剂26
• 1.5. 主要使用药物26
• 2. 主要实验设备26-27
• 3. 主要溶液配置27
• 3.1. 细胞冻存液的配制27
• 3.2. 细胞裂解液的配制27
• 3.3. SDS-PAGE蛋白质电泳及相关缓冲液的配制27
• 3.4. 常用缓冲液的配置27
• 4. 实验方法27-41
• 4.1. H5N1禽流感病毒感染患者和健康对照者入组和基本信息27-28
• 4.2. 人血浆AngⅡ的测定28-29
• 4.3. 小鼠血浆AngⅡ的测定29-31
• 4.4. 小鼠肺组织病毒50%培养组织感染剂量(TCID_(50))的测定31-32
• 4.4.1. 流感病毒TCID_(50)测定组肺组织样品收取和处理31-32
• 4.4.2. 流感病毒50%培养组织感染剂量(TCID_(50))的测定32
• 4.5. 小鼠肺组织RNA收取和基因表达变化检测32-35
• 4.5.1. 肺组织样品收取和处理32-33
• 4.5.2. 小鼠肺组织样品RNA提取33-34
• 4.5.3. RNA逆转录成cDNA34
• 4.5.4. 荧光实时定量PCR检测目的基因的表达变化34-35
• 4.6. 小鼠肺组织湿干重量比测定35-36
• 4.7. 小鼠肺组织病理检测及炎性浸润细胞计数和肺损伤程度评分36-37
• 4.8. 细胞转染质粒37
• 4.9. 细胞RNA样品收取和荧光实时定量PCR检测37-38
• 4.9.1. 细胞RNA样品收取和处理38
• 4.9.2. 荧光实时定量PCR检测Ace2基因变化38
• 4.10. 细胞和肺组织蛋白样品收取和Western Blotting检测38-41
• 4.10.1. 细胞蛋白样品收取和处理38
• 4.10.2. 肺组织蛋白样品收取和处理38-39
• 4.10.3. 细胞和组织蛋白样品浓度测定和调整39-40
• 4.10.4. Western blotting检测40-41
• 4.11. 小鼠生存率检测41
• 5. 实验结果41-55
• 5.1. H5N1病毒感染病人血清中Ang Ⅱ水平升高41-42
• 5.2. H5N1病毒感染死亡病人Ang Ⅱ表达持续升高42-43
• 5.3. H5N1病毒感染死亡小鼠Ang Ⅱ表达持续升高43-44
• 5.4. Ace2基因敲除有利于病毒基因复制44
• 5.5. Ace2基因敲除小鼠肺组织中病毒含量更高44-45
• 5.6. 注射ACE2蛋白可以降低病毒复制45-46
• 5.7. 注射ACE2蛋白可以降低Ang Ⅱ表达46
• 5.8. ACE2蛋白单独治疗可以改善小鼠肺水肿程度46-47
• 5.9. ACE2蛋白单独治疗可以改善小鼠肺组织病理损伤程度47-48
• 5.10. ACE2蛋白单独治疗可以降低Ang Ⅱ表达48
• 5.11. 单个H5N1病毒蛋白对Ace2 mRNA表达水平没有影响48-49
• 5.12. 单个H5N1病毒蛋白对ACE2蛋白表达水平没有影响49-50
• 5.13. 使用氯沙坦治疗可以显著提高小鼠生存率50-51
• 5.14. 使用氯沙坦治疗可以改善小鼠肺水肿程度51-52
• 5.15. 使用氯沙坦治疗可以改善小鼠肺组织病理损伤程度52
• 5.16. 使用氯沙坦治疗对H5N1病毒复制没有影响52-53
• 5.17. 使用氯沙坦治疗可降低肺组织ⅡL-6表达量53-54
• 5.18. 使用氯沙坦治疗可促进RAS稳态平衡54-55
• 6. 实验结论55-56
• 7. 讨论56-58
• 第二节 H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤的候选临床治疗药物筛选58-89
• 前言58-60
• 1. 实验材料60
• 1.1. 实验动物60
• 1.2. 实验试剂60
• 1.2.1. 试剂盒60
• 1.2.2. 细胞株60
• 1.2.3. 病毒株60
• 1.3. 主要生化试剂和抗体60
• 1.4. 细胞培养及转染试剂60
• 1.5. 主要使用药物60
• 2. 主要实验设备60-61
• 3. 主要溶液配置61-62
• 3.1. 细胞冻存液的配制61
• 3.2. 细胞裂解液的配制61
• 3.3. SDS-PAGE蛋白质电泳及相关缓冲液的配制61-62
• 3.4. 常用缓冲液的配置62
• 4. 实验方法62-71
• 4.1. 氯喹预防或治疗H5N1病毒感染A549细胞的细胞活力测定62-63
• 4.2. 小鼠生存率检测和体重变化统计63-64
• 4.3. 小鼠肺组织湿干重量比测定64
• 4.4. 小鼠肺组织病理检测及炎性浸润细胞计数64-65
• 4.5. qRT-PCR检测小鼠肺组织mRNA表达变化65-68
• 4.5.1. 肺组织样品收取和处理65-66
• 4.5.2. 小鼠肺组织样品RNA提取66
• 4.5.3. RNA逆转录成cDNA66-67
• 4.5.4. 荧光实时定量PCR检测目的基因的表达变化67-68
• 4.6. Western Blotting检测小鼠肺组织蛋白表达变化68-71
• 4.6.1. 肺组织蛋白样品收取和处理68-69
• 4.6.2. 细胞和组织蛋白样品浓度测定和调整69-70
• 4.6.3. Western blotting检测70-71
• 5. 实验结果71-86
• 5.1. 氯喹可挽救H5N1型禽流感病毒导致的细胞死亡71-72
• 5.2. 氯喹预防给药不能明显提高小鼠生存率72
• 5.3. 氯喹预防给药不能明显改善小鼠肺水肿程度72-73
• 5.4. 氯喹预防给药不能明显改善小鼠肺组织病理损伤程度73-74
• 5.5. 氯喹治疗给药可以明显提高小鼠生存率74
• 5.6. 氯喹治疗给药可以明显改善小鼠肺水肿程度74-75
• 5.7. 氯喹治疗给药可以明显改善小鼠肺组织病理损伤程度75-76
• 5.8. 氯喹治疗给药后小鼠肺组织自噬程度显著降低76
• 5.9. 氯喹治疗给药后对H5N1病毒复制没有影响76-77
• 5.10. 使用氯喹治疗不能降低肺组织炎性因子表达量77-78
• 5.11. H5N1型禽流感病毒滴鼻感染小鼠模型生存率78-79
• 5.12. H5N1型禽流感病毒滴鼻感染小鼠模型体重变化79
• 5.13. 依那普利治疗不能显著提高小鼠生存率79-80
• 5.14. 依那普利治疗不能缓解小鼠体重下降80-81
• 5.15. 依那普利治疗不能显著缓解小鼠肺水肿81
• 5.16. 卡托普利治疗不能显著提高小鼠生存率81-82
• 5.17. 卡托普利治疗不能缓解小鼠体重下降82
• 5.18. 卡托普利治疗不能缓解小鼠肺水肿82-83
• 5.19. 辛伐他汀治疗不能显著提高小鼠生存率83
• 5.20. 辛伐他汀治疗不能缓解小鼠体重下降83-84
• 5.21. 辛伐他汀治疗不能缓解小鼠肺水肿84
• 5.22. 普伐他汀治疗不能缓解小鼠肺水肿84-85
• 5.23. 普伐他汀和氯沙坦联合治疗不能缓解小鼠肺水肿85-86
• 6. 结论86-87
• 7. 讨论87-89
• 第二部分 氧化铜(CuO)纳米颗粒可引起A549细胞产生自噬性的细胞死亡89-108
• 前言90-91
• 1. 实验材料91-92
• 1.1. 实验试剂91
• 1.1.1. 试剂盒91
• 1.1.2. 细胞株91
• 1.1.3. LC3-GFP2表达质粒91
• 1.2. 主要生化试剂和抗体91
• 1.3 细胞培养及转染试剂91
• 1.4 纳米颗粒和药物91-92
• 2. 主要实验设备92
• 3. 主要溶液配置92-93
• 3.1. 细胞冻存液的配制92
• 3.2. 电镜样品固定液的配置92-93
• 3.3. 常用缓冲液的配置93
• 3.4. 细胞裂解液的配制93
• 3.5. SDS-PAGE蛋白质电泳及相关缓冲液的配制93
• 4. 实验方法93-99
• 4.1. 氧化铜纳米颗粒感染A549细胞后细胞活力检测93-94
• 4.2. 氧化铜纳米颗粒感染A549细胞电镜观察94-95
• 4.3. 氧化铜纳米颗粒感染A549细胞荧光共聚焦显微镜观察95-96
• 4.4. 氧化铜纳米颗粒引起A549细胞自噬潮现象检测96-99
• 4.4.1. BFA1处理细胞蛋白样品收集96
• 4.4.2. 蛋白样品浓度测定与调整96-97
• 4.4.3. Western blotting检测自噬潮现象97-98
• 4.4.4. Western blotting定量分析98-99
• 4.5. Atg 5基因siRNA转染实验99
• 5. 实验结果99-106
• 5.1. 氧化铜纳米颗粒可导致A549细胞死亡且呈梯度效应100
• 5.2. 氧化铜纳米颗粒可增加A549细胞中的自噬小泡100-101
• 5.3. 氧化铜纳米颗粒可促进LC3蛋白聚集101-102
• 5.4. 氧化铜纳米颗粒可引起自噬潮102-103
• 5.5. 敲低Atg 5基因可挽救氧化铜纳米颗粒导致的细胞死亡103
• 5.6. 敲低Atg 5基因可降低细胞自噬程度103-104
• 5.7. 敲低Atg 5基因可挽救氧化铜纳米颗粒导致的细胞死亡104-105
• 5.8. 自噬抑制剂可挽救氧化铜纳米颗粒导致的细胞死亡105-106
• 6. 结论106-107
• 7. 讨论107-108
• 参考文献108-116
• 综述116-132
• 参考文献123-132
• 致谢132-133
• 个人简历133-136

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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本文编号：694735