香烟提取物对人肺泡Ⅱ型上皮细胞MMP-9、TIMP-1分泌的影响及意义

发布时间：2017-08-19 01:04

  本文关键词：香烟提取物对人肺泡Ⅱ型上皮细胞MMP-9、TIMP-1分泌的影响及意义

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【摘要】：目的：研究表明，香烟烟雾中的有害毒性物质多达上千种，是多种肺部疾病的共同危险因素。也有研究提出，吸烟可能与特发性肺纤维化(IPF)的发病有着密切的关联，但其具体作用机制尚不完全清楚。香烟烟雾中含有多种炎症介质，包括氧化剂(coxidant)和朊酶类(proteases)等，最终可导致蛋白酶/抗蛋白酶失衡参与众多肺部疾病的发病。近年，在肺间质纤维化的形成机制中，MMPs/TIMPs（金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制剂）比例失衡逐渐成为研究的热点和重点。其中，MMP-9（基质金属蛋白酶-9）作为一种重要的基质金属蛋白酶，在细胞外基质降解、肺组织结构重塑等多种生理病理过程中发挥重要作用，参与多种肺部疾病的发生，其活性受特异性抑制剂，即基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的调节。在各种外界刺激因素的作用下，二者比例及相互作用发生紊乱，可导致细胞外基质降解受阻、细胞外蛋白沉积、肺组织重构等病理改变，从而参与肺间质纤维化(pulmonary interstitial fiberosis)的发病。 本实验旨在通过研究香烟提取物(cigerette smoking extract，CSE)对体外培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的人A549细胞分泌基质金属蛋白酶9(matrixMetalloproteinase-9，MMP-9)及其组织抑制因子(tissue inhibitorofmetal loproteinase-l，TIMP-1)的影响，探讨吸烟作为一种危险因素参与肺间质纤维化过程的可能机制。 方法：体外培养人A549细胞，取指数生长期细胞用于实验。两支去过滤嘴香烟由经改造的50ml注射器负压吸引装置连续匀速抽吸燃烧着，将烟雾经另一出口入20ml1640培养基中制成悬液。15分钟内将2支香烟燃尽。充分摇动使其溶解，用氢氧化钠（NAOH）将pH调至7.4左右，0.22um孔径的滤器过滤，除去细菌和杂质，所得溶液在30分钟内用于实验。将原液配成不同浓度干预人A549细胞24小时，并依据浓度的不同将实验分为四组：对照组、 A组（2.5％CSE干预组）、B（5％CSE干预组）、C（10％CSE干预组）。并分别收集C组干预A549细胞0h，3h，6h，9h，12h，48h的培养上清液。光学倒置电子显微镜分别观察四组细胞干预24小时后的形态学变化；酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测上清液中MMP-9、TIMP-1的浓度；分别收集干预24h后各组培养细胞，提取细胞中的蛋白质， BCA法测定蛋白浓度，Western Blot法检测细胞中MMP-9、TIMP-1蛋白的表达。 结果： 1、细胞形态学变化 倒置显微镜观察各组培养24小时后的细胞形态。对照组细胞表现为贴壁、扁平梭形生长，细胞形态规则，细胞生长旺盛。在经过不同CSE浓度干预后的A（2.5％CSE干预组）、B（5％CSE干预组）、C（10％CSE干预组）三组细胞形态较对照组差异较大，且呈现出干预浓度越高，细胞生长情况越差的特点。主要表现为细胞数量减少、体积缩小，细胞贴壁能力下降，细胞之间空间增大。而C组细胞形态变化较对照组更为显著。大部分细胞已回缩变圆且细胞密度明显减低，胞内颗粒状物质明显增多，细胞贴壁能力大大减低。 2、CSE干预后A549细胞分泌MMP-9的变化 ELISA结果显示，对照组MMP-9含量为（1.70±0.12ng/ml），A、B、C三组浓度呈现逐渐升高趋势，三组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)，且A、B、C三组之间相互比较差异也具有统计学意义(P0.05)。同时，观察C组作用不同时间MMP-9的表达我们可以发现，随着作用时间的延长，其表达呈不断升高趋势。0h时其浓度为（1.76±0.31ng/ml），48h时其浓度最高达到（9.29±0.76ng/ml）。经过统计学分析可以得出结论，3h-48h各组与0h比较差异均具有统计学意义(P0.05)，9h-48h与3h比较差异具有统计学意义(P0.05)。 3、CSE干预后A549细胞分泌TIMP-1的变化 ELISA结果显示，对照组TIMP-1含量为（2.20±0.31ng/ml），A、B、C三组浓度呈现逐渐升高趋势，三组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)，且A、B、C三组之间相互比较也具有统计学意义(P0.05)。同时，观察C组作用不同时间TIMP-1的表达我们可以发现，随着作用时间的延长，其表达呈不断升高趋势。0h时其浓度为（2.52±0.41ng/ml），48h时其浓度最高达到（16.31±0.96ng/ml）。经过统计学分析可以得出结论，3h-48h各组与0h比较差异均具有统计学意义(P0.05)，9h-48h与3h比较差异具有统计学意义(P0.05)。 4、CSE干预后A549细胞MMP-9/TIMP-1的变化 ELISA结果显示在A549细胞培养24小时后，对照组MMP-9/TIMP-1数值为（0.77±0.05），而在经CSE干预后的A、B、C三组数值相比对照组均降低，三组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)，，但各组间两两比较差异均无统计学意义(P0.05)。观察C组在干预的不同时间MMP-9/TIMP-1比值的变化发现，12h、24h及48h与0h比较具有统计学意义(P0.05)，而3h、6h及9h与0h比较无明显统计学意义。0h、6h与3h比较差异无明显统计学意义，而9h、12h、24h、48h与3h比较差异则具有统计学意义(P0.05)。 5、 CSE干预A549细胞24h后MMP-9、TIMP-1蛋白的表达 各组细胞干预24小时后Western Blot显示，对照组MMP-9及TIMP-1蛋白表达较少，而A、B、C各组两种蛋白表达均较对照组升高，且随着干预浓度的升高蛋白表达逐渐增加。 结论： 1、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌MMP-9、TIMP-1增加。 2、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌MMP-9、TIMP-1增加，且呈现出时间及浓度依赖性。 3、CSE能引起MMP-9/TIMP-1比例失衡，并呈现出先高后低的趋势。 4、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮细胞产生MMP-9/TIMP-1比例失衡，其作为危险因素可能通过这一机制参与吸烟相关性肺间质纤维化的形成过程。
【关键词】：香烟提取物(CSE) 人A549细胞 基质金属蛋白酶-9(MMP-9) 基质金属蛋白酶组织抑制因子-l(TIMP-1) 肺间质纤维化（pulmonary interstitial fiberosis）
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-19
• 结果19-21
• 附图21-27
• 附表27-28
• 讨论28-31
• 结论31
• 参考文献31-34
• 综述 基质金属蛋白酶及细胞因子之间的关系与肺间质纤维化34-44
• 参考文献40-44
• 致谢44-45
• 个人简历45

【参考文献】

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1 戴莉莉,秦斌斌,陈晓红,祝捚;慢性阻塞性肺疾病合并肺间质纤维化的临床研究[J];上海第二医科大学学报;2004年09期

2 谭善忠;刘成海;张炜;陆雄;叶伟成;蔡贞贞;刘平;;MMP-2/9活性与TIMP-1/2蛋白表达在大鼠肺纤维化形成中的变化特点[J];中西医结合学报;2006年04期

3 韩照升,徐军,钟南山;人支气管上皮细胞表达基质金属蛋白酶9的实验研究[J];中华结核和呼吸杂志;2000年12期

4 谢丽华;陈平;陈芳;向旭东;周锐;吴尚洁;;香烟提取物对人内皮细胞基质金属蛋白酶9和组织金属蛋白酶抑制剂1分泌的影响[J];中华结核和呼吸杂志;2006年10期

本文编号：697761