应用等位基因差异表达探索肺部疾病的遗传机制

发布时间：2017-08-21 08:26

  本文关键词：应用等位基因差异表达探索肺部疾病的遗传机制

  更多相关文章： GWAS 肺癌 COPD ASE

【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌是两种常见的肺部疾病。COPD特征为持续存在的气流受限,目前排全世界死亡原因的第三位。肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率快速增长,是一种严重威胁人类健康和生命的疾病。多项研究表明,在C OPD和肺癌的发生中,遗传因素起着重要的作用。因此,研究COPD.肺癌疾病发生相关的基因与致病位点的致病机制,对于这两种疾病的预防和治疗有着重要意义。为寻找与这两种肺部疾病相关的变异,科学界开展了多项全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS),大大深化了人类对于其发病机理的认识,但也存在一些问题仍待解决。首先,GWAS发现的只是遗传标记,而非真实的致病位点。其次,GWAS无法解释这些突变的致病机理。等位基因差异表达(allele-specific expression,ASE)作为一种特殊的遗传学现象,成为一种筛选功能性突变的新手段。这种方法,由于(1)可以消除组织生理状态等因素的影响,极为准确和灵敏；(2)对样本数量要求不高；(3)检测手段简单可靠、成本低、耗时短;(4)受调控目标基因明确；(5)可大大缩小搜索功能性位点的范围,提高研究效率,因此被多位研究人员使用,进行功能性突变的确定和机理研究。完成的内容以及结论：本研究收集前期肺部疾病GWAS研究的阳性结果,从中挑选45个编码区突变,使用SNaPshot对其ASE进行检测,发现8个位点存在ASE现象,其中最显著的分别是与COPD疾病相关的P2RX7基因位点rs3751143、PSORS1C1基因位点rs1265093以及与肺癌相关的CHRNA3 基因位点rs1051730这三个位点,表明与其连锁的突变可调控这些基因表达。通过质粒载体构建、突变生成、双荧光素酶报告基因等功能基因组学手段确定了19个功能突变。然后通过染色质免疫共沉淀、染色质构象捕获确定了rs11615997与rs115664826位点通过改变POU2F1转录因子结合分别调控P2RX7和PSORS1C1基因的表达,影响COPD的易感性。研究的意义：本研究有助于阐明这些肺部疾病相关基因的表达调控机制,为系统地了解疾病机理奠定基础。同时,通过小分子化合物阻断关键蛋白质作用,是癌症化疗的主要手段。因此,对于相关致病基因的确定,可为癌症药物设计和治疗提供新的靶标。其次,本研究可为综合应用ASE和功能基因组学手段,研究其他疾病相关基因的表达调控、鉴别人类基因组功能性区域提供一个良好的范例。此外,考虑到基因的多效性,本研究对于所涉及基因相关的其他疾病,可能亦有非常重要的参考价值。论文解决的主要问题：COPD与肺癌的遗传机制。论文的创新点：常见的基于GWAS的功能基因组学研究,多基于大样本的精细定位进行。本研究基于少量样本的ASE开展,以快速确定可调控基因表达的致病突变的存在,避免了统计学方法可能产生的假阳性,进而开展详尽功能基因组学分析,大大节约了时间以及相关人力物力,是本研究的主要创新之处。
【关键词】：GWAS 肺癌 COPD ASE
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.9;R734.2
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 研究背景简介10-17
• 1 慢性阻塞性肺疾病COPD10-12
• 1.1. COPD简介10
• 1.2. COPD病因10-11
• 1.3. COPD并发症及治疗现状11-12
• 1.4. COPD与GWAS12
• 2 肺癌12-15
• 2.1 肺癌简介12-13
• 2.2 肺癌病因与治疗现状13-14
• 2.3 肺癌与GWAS14-15
• 3 GWAS和基于GWAS的功能研究及缺点15-16
• 4 等位基因差异表达(allele-specific expression,ASE)简介16
• 5 研究目的和意义16-17
• 第二章 材料与方法17-78
• 1 材料17-19
• 1.1 细胞系、质粒和感受态细胞17
• 1.1.1 细胞系17
• 1.1.2 质粒17
• 1.1.3 受体细胞17
• 1.2 实验试剂17-19
• 1.2.1 实验主要使用的生化分子试剂17-18
• 1.2.2 实验所用的试剂盒18
• 1.2.3 实验所用的酶18-19
• 1.3 主要使用软件19
• 1.4 样品来源19
• 2 主要实验仪器与设备19-20
• 3 实验方法20-78
• 3.1 GWAS结果收集20
• 3.2 DNA、RNA提取(人正常血液和肺部组织)20-23
• 3.2.1 酚氯仿抽提法-提取人正常血液和肺部组织DNA20-22
• 3.2.2 提取人正常肺部组织总RNA22-23
• 3.3 肺部组织总RNA反转录成cDNA23-24
• 3.4 等位基因差异表达ASE24-35
• 3.4.1 引物最适温度(PCR gradient)24-25
• 3.4.2 基因分型与ASE分析25-35
• 3.5 分子克隆35-42
• 3.5.1 候选基因P2RX7、CHRNA3、PSORS1C135
• 3.5.2 制备感受态细胞35-36
• 3.5.3 酶切及测序引物36-42
• 3.5.4 获取带有酶切位点的目的片段42
• 3.6 载体构建42-46
• 3.7 定点突变生成46-53
• 3.8 转染BEAS-2B细胞与功能位点筛选53-57
• 3.8.1 BEAS-2B细胞复苏传代与冻存53-55
• 3.8.2 BEAS-2B细胞转染55-56
• 3.8.3 表达量检测56-57
• 3.9 功能基因组学分析57-78
• 3.9.1 染色质免疫共沉淀(ChIP)57-64
• 3.9.2 染色质构象捕获3C64-78
• 3.9.2.1 BAC提取65-67
• 3.9.2.2 BAC酶切酶连67-70
• 3.9.2.3 BEAS-2B细胞酶切酶连70-73
• 3.9.2.4 3C产物RT-qPCR73-78
• 第三章 结果78-89
• 1 GWAS结果收集78
• 2 等位基因差异表达结果78-80
• 3 分子克隆、构建载体和转染双荧光素酶表达结果80-85
• 3.1 P2RX7双荧光报告基因结果80-81
• 3.2 PSORS1C1双荧光报告基因结果81-82
• 3.3 CHRNA3双荧光报告基因结果82-85
• 4 染色质构象捕获3C结果85-87
• 5 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果87-89
• 第四章 讨论与展望89-90
• 附录90-92
• 1 附录1 论文中使用的缩写及英文对照90-91
• 2 附录2 常用数据库与网上生物学资源91-92
• 参考文献92-97
• 硕士在读期间参与基金项目、发表论文、荣誉与奖励97-98
• 1 参与的基金项目97
• 2 发表和投稿的论文97
• 3 荣誉与奖励97-98
• 致谢98

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 章静波;;《大鼠肝再生的功能基因组学研究》出版[J];基础医学与临床;2010年02期

2 谢建平,乐军,王洪海;功能基因组学和组合化学在抗结核新药开发中的应用[J];中国医药工业杂志;2002年05期

3 艾琳;陈韶红;陈家旭;;重要人兽共患寄生虫功能基因组学研究进展[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2011年01期

4 ;上海市以网络会议形式论证重点实验室[J];科学新闻;2001年38期

5 田小军;薛燕萍;;表达序列标签在寄生虫功能基因组学研究中的应用[J];中国病原生物学杂志;2008年03期

6 ;“中国遗传学会功能基因组学研讨会”将于10月在成都召开[J];癌变.畸变.突变;2006年03期

7 牛朝霞;;RNAi在哺乳动物细胞功能基因组学研究中的应用[J];河南职工医学院学报;2009年01期

8 张可满;动脉粥样硬化研究中的功能基因组学和DNA阵列技术[J];武警医学院学报;2001年04期

9 成军;功能基因组学中的功能缺失研究策略[J];世界华人消化杂志;2004年10期

10 朱睿,张开立,邹向阳;RNA干扰(RNAi)技术及其在功能基因组学研究中的应用[J];大连医科大学学报;2003年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 朱兴全;黄翠琴;邹丰才;林瑞庆;陈宁;周鹏;宋慧群;;寄生虫功能基因组学研究的几种方法[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年

2 朱兴全;林瑞庆;宋慧群;;功能基因组学:我们可以做什么?[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C];2004年

3 ;中国遗传会功能基因组学研讨会会务组[A];中国遗传学会功能基因组学研讨会论文集[C];2006年

4 朱兴全;林瑞庆;宋慧群;;功能基因组学:我们可以做什么?[A];中国动物学会全国第九次寄生虫学学术讨论会论文摘要集[C];2003年

5 余东;;植物病毒载体在功能基因组学研究中的应用[A];第二届热带亚热带植物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2006年

6 朱玉贤;;棉纤维伸长机制的转录组学与功能基因组学研究进展[A];中国遗传学会植物遗传和基因组学专业委员会2007年学术研讨会摘要集[C];2007年

7 李建远;王海燕;刘芙君;;人类附睾功能基因组学研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

8 ;中国科协青年科学家论坛第八十次活动主题简介[A];后基因组时代的基因功能研究——青年科学家论坛第八十次活动论文集[C];2003年

9 庄永龙;马飞;李岭;李衍达;;基于典型调控环节的分子调控网络建模[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年

10 ;2011全国植物生物研讨会[A];2011全国植物生物学研讨会论文集[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 方敏;上海建脑功能基因组学重点实验室[N];科技日报;2001年

2 钟石 王兴东 张晔;南医大构建我国功能基因组学科研高地[N];科技日报;2002年

3 钱卓;中国的机遇与挑战[N];科技日报;2002年

4 黄辛;华师大构建我国首批“试管猴”[N];上海科技报;2008年

5 记者　郑晋鸣　　通讯员　冷明祥;江苏院士领衔主攻疾病基因[N];光明日报;2002年

6 ;我国功能基因组学研究又取得新进展[N];中国高新技术产业导报;2003年

7 刘军;一种经过改进基因的“聪明鼠”问世[N];中国高新技术产业导报;2001年

8 陈善爱;生物科技网上行[N];中国电脑教育报;2004年

9 余志平;打开功能基因组学与未来治疗学的大门[N];中国医药报;2004年

10 张泓;泰达，，科技创新步伐铿锵[N];北方经济时报;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 彭涛;应用等位基因差异表达探索肺部疾病的遗传机制[D];云南大学;2016年

2 杨坤;γ-Tubulin dsRNA载体的构建及其在烟草细胞中的功能研究[D];首都师范大学;2006年

本文编号：711841