地龙提取物减弱矽尘诱导的小鼠肺纤维化机制研究

发布时间：2017-09-13 04:11

  本文关键词：地龙提取物减弱矽尘诱导的小鼠肺纤维化机制研究

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【摘要】：矽肺是由于长期吸入游离二氧化硅(silicon dioxide,SiO_2)粉尘所致的以进行性、结节性纤维化及弥漫性肺间质纤维化为主的疾病,是尘肺中最常见、进展最快、危害最严重的一种类型。在我国,矽肺是发病率最高的职业病之一,目前,我国矽肺的发病率总体呈上升趋势,中国卫生部的职业病报告数据显示,2014年新诊断尘肺病26873例,占所有报告职业病的89.66%,其中11471例(42.69%)为矽肺。由于矽肺发病机制仍然不完全清楚,迄今无特效治愈方法。随着对肺纤维化发生机制研究的不断深入,越来越多的证据表明氧化应激在肺纤维化疾病(包括矽肺)的发展中有着至关重要的作用。外源的活性氧化剂以及那些在炎症细胞、上皮细胞等细胞里内源性产生的活性氧类物质均可造成机体的氧化应激。在肺纤维化中,氧化应激可导致异常的上皮细胞损伤反应,包括细胞因子表达增多、上皮间质转化、上皮细胞凋亡等。机体内除氧化系统外,还存在着由各种抗氧化酶类和抗氧化剂等组成的抗氧化防御系统。转录因子Nrf2是调节这些抗氧化基因表达的关键因子。地龙是一种众所周知的传统中药,并且作为功能性的食物成分已被用来治疗疾病以及促进健康,其提取物(earthworm extract,EE)的主要活性成分为蚓激酶,含有胶原酶、纤溶酶、纤溶酶原激活物等,以降低血液黏稠度、减少血小板聚集、改善微循环、体内外良好的溶栓抗凝作用而广泛应用于心脑血管疾病的治疗。除了抗凝和纤溶活性,地龙提取物还有多种生物学功能,包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等,从而可能为肺纤维化提供保护作用。我们课题组前期的动物实验已经表明,EE减弱了Si02诱导的小鼠肺部炎症及纤维化,改善了肺组织结构和功能。为了探讨EE减弱矽肺纤维化的作用机制,我们利用小鼠矽肺体内模型及支气管与肺泡上皮细胞(HBE和A549)染尘体外模型,研究EE对Si02诱导的氧化应激、上皮细胞凋亡和上皮间质转化的影响。目的建立Si02诱导的小鼠肺纤维化体内模型,构建HBE和A549细胞染尘体外模型,探讨EE减弱矽肺纤维化的作用机制,为EE在矽肺上的应用提供基础的实验数据,进而扩大EE的临床应用范围,为矽肺的防治提供有效的新药物。方法(1)建立Si02诱导的小鼠肺纤维化模型,设立生理盐水组、矽尘组、EE干预组3个实验组。(2)利用HBE和A549细胞建立染尘体外模型,N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作为阳性对照,CCK8法筛选SiO_2、EE、NAC的作用剂量和时间,评价EE对Si02诱导的细胞毒性的改善作用。(3)Hoechst 33258染色体外观察EE对SiO_2诱导的细胞凋亡的作用。(4)JC-1染色检测线粒体膜势能水平,荧光素酶法检测细胞内ATP水平,评价EE对Si02诱导的线粒体损伤的影响。(5)免疫荧光观察细胞内细胞色素c的表达及分布,Western blot检测肺组织及细胞内线粒体凋亡通路相关蛋白的表达水平,分析EE对Si02活化的线粒体凋亡通路的影响。(6)Western blot检测肺组织及细胞内上皮间质转化标志物及细胞因子的蛋白表达水平,分析EE对Si02诱导的上皮间质转化及细胞因子产生的影响。(7)DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧类物质水平,试剂盒检测血清及细胞内TSOD、MDA、GSH水平,评价EE对Si02诱导的氧化应激的影响。(8)Western blot检测肺组织及细胞内Nrf2的蛋白表达水平,免疫荧光观察细胞内Nrf2的表达及分布,qRT-PCR检测肺组织及细胞内NQO-1和HO-1的mRNA水平,分析EE对Nrf2通路的活化作用。(9) Nrf2-siRNA干涉Nrf2的表达后,CCK8法检测细胞活性,DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧类物质水平,JC-1染色检测线粒体膜势能水平,Western blot检测细胞内线粒体凋亡通路相关蛋白和上皮间质转化标志物蛋白表达水平,分析Nrf2在EE保护Si02诱导的肺纤维化中的作用。(10)数据以来自3次实验结果的均数±标准差表示,由Graphpad Prism 5.0软件进行处理。多组计量资料的比较应用单因素方差分析及事后比较；两组计量资料的比较应用t检验。P0.05表示有统计学差异。SPSS 20.0软件用于统计学分析。结果1.CCK8结果显示,SiO_2以剂量和时间依赖的方式显著抑制了HBE和A549细胞的活性。200μg/ml SiO_2处理24小时使HBE和A549细胞活性降低至50%左右,因而作为后续实验的处理条件。1和2 U/μl的EE以及0.1和1mM的NAC明显增强了HBE和A549的细胞活性,因而作为后续实验的干预条件。2. Hoechst 33258结果显示,在HBE和A549细胞中,与对照组相比,Si02处理导致了凋亡细胞数量的显著增加,而EE或NAC干预明显抑制了细胞凋亡。3.线粒体荧光染料JC-1染色结果显示,与对照组相比,Si02刺激HBE和A549细胞导致线粒体膜势能下降；然而EE或NAC干预抑制了线粒体膜势能的破坏。SiO_2处理组细胞内ATP含量较对照组明显降低,而EE或NAC干预恢复了细胞内ATP水平。4.免疫荧光结果显示,Si02诱导了细胞色素c从线粒体释放至细胞质,而EE或NAC干预阻止了细胞色素c的释放。Western blot结果显示,与对照组相比,Si02处理组HBE和A549细胞及肺组织内细胞色素c、cleaved-caspase 9、 cleaved-caspase 3、 Bax蛋白表达水平显著增加,Bcl-2蛋白水平明显降低,但EE干预逆转了这些变化。5. Western blot结果显示,在HBE和A549细胞及肺组织内,与对照组相比,Si02处理显著增加了TGF-β1、IL-1β、pPAI-1的蛋白水平,而EE干预明显减少了细胞因子的表达。并且,Si02处理显著减少了E-钙粘素的蛋白水平而增加了α-SMA的表达,EE干预则抑制了EMT。6. DCFH-DA试验结果显示,在HBE和A549细胞内,SiO_2刺激显著升高了活性氧类物质水平至对照组的3倍左右,而EE或NAC干预明显抑制了活性氧类物质水平的增加。并且,Si02刺激显著降低了HBE和A549细胞及血清中TSOD活性及GSH/GSSG水平并升高了MDA含量,而EE干预明显增高了TSOD活性并减少了MDA含量。7. Western blot结果显示,在HBE和A549细胞及肺组织内,Si02增加了Nrf2的蛋白水平,而EE干预后进一步增加了Nrf2的表达。免疫荧光结果显示,在HBE和A549细胞内,EE促进了Nrf2的核转位。在HBE和A549细胞及肺组织中,Si02刺激上调了NQO-1和HO-1的mRNA水平,EE干预后又进一步增加了NQO-1和HO-1的mRNA水平。8.在HBE和A549细胞内,Nrf2 siRNA有效地下调了Nrf2的表达,在野生型细胞中,EE (2 U/μl)干预明显抑制了SiO_2诱导的细胞毒性、活性氧类物质升高、线粒体膜势能降低、线粒体凋亡通路、上皮间质转化。而在Nrf2基因沉默细胞中,EE并不能抑制SiO_2诱导的纤维化反应。结论机制研究提示EE可能通过激活Nrf2通路,减弱SiO_2诱导的氧化应激,进而抑制上皮细胞线粒体凋亡通路及上皮间质转化,最终干预矽肺纤维化的发生发展。
【关键词】：地龙提取物 矽肺 Nrf2 线粒体凋亡通路 上皮间质转化
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R135.2
【目录】：

• 缩略语5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-20
• 材料与方法20-37
• 结果37-55
• 讨论55-59
• 结论59-60
• 参考文献60-69
• 综述69-87
• 参考文献78-87
• 附录87-88
• 硕士期间发表论文88-89
• 致谢89

【参考文献】

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1 刘丽芳;文秀英;许明旺;刘浩;陈爱萍;张泓;黄文凡;熊亮;;贞清方与地龙对2型糖尿病大鼠肾组织TGF-β_1及PAI-1表达的影响[J];中国中西医结合杂志;2011年07期

2 齐杰;刘艳超;李清君;陈晓玲;;银杏叶提取物对大鼠肺纤维化的影响及其机制的研究[J];中国中药杂志;2010年22期

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本文编号：841433