油酸致A549细胞损伤模型建立及其对SP-B影响研究

发布时间：2017-09-13 15:19

  本文关键词：油酸致A549细胞损伤模型建立及其对SP-B影响研究

  更多相关文章： 急性肺损伤 OA干预 LPS干预 肺表面活性物质B 定量研究

【摘要】：主要目的:大量研究显示油酸(oleic acid,OA)所致急性肺损伤(acute lung injury,ALI)动物模型的病理学变化与与临床极为相似,但其致伤机制尚不太明确,且国内外关于OA致伤的体外模型层面研究较少。我们尝试建立OA刺激致肺泡II型上皮细胞株A549细胞损伤的体外模型,并探讨不同浓度OA损伤对A549细胞SP-B的影响。主要实验内容和方法:1.实验分组:A549细胞培养至3代后,融合率80%。(1)对照组:不加入OA,替代以实验组等量的DMEM(不含胎牛血清),37℃孵箱培养24h;(2)AO组:按照AO终浓度分别分为300umol/L、400 umol/L、500 umol/L及600 umol/L 4个亚组,37℃孵箱培养24h;LPS组:(1)对照组:同OA对照组;(2)实验组:按照0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及100ug/ml的LPS浓度分为4个实验组,37℃孵箱培养24h;2.光镜观察细胞形态学变化,CCK-8法检测细胞增殖活性:细胞长势符合实验要求后,按实验分组浓度刺激。先用倒置显微镜,200倍镜下观察细胞形态学变化并拍照。加入CCK-8,采用GEN5软件及酶标仪,进行OD值检测。3.ELISA检测SP-B表达:各组细胞按4×104个/ml接种于96孔孔板中,5个复孔每组,共需接5组。每孔上清液于24h后收集,按ELISA试剂盒操作说明书对收集的上清液进行SP-B表达检测分析。4.Western Blot检测SP-B分泌:细胞传至3代以后,对上清液及细胞进行程序化处理,按照Western Blot检测试剂盒操作说明书对收集的SP-B分泌及表达水平进行检测。5.统计学分析:统计学软件采用SPSS16.0,有效数字保留小数点后2位,计量资料采用sx?形式表达,计量资料采用单因素方差分析。当P值小于0.05时,我们认为差异有统计学意义。主要研究结果:1.细胞形态学变化:OA对照组A549细胞胞质丰富、呈多角形,细胞突起明显,贴壁性生长,融合成片,无核固缩;300umol/L组,细胞胞体轻微变圆,体积略微缩小,突起逐渐减少,少量大小不均的颗粒开始出现于胞质内;400 umol/L组,细胞胞体比较明显的变圆,体积变小,有较多的突起变少,比较多大小不均的颗粒开始出现于胞质内;500 umol/L及600 umol/L组,细胞器开始崩解,碎裂,基本无完整的细胞胞体,皱缩的细胞核开始大量出现。LPS各组随LPS浓度增加与OA组形态学变化一致。2.CCK-8检测细胞增殖活性:CCK-8检测检测显示300、400、500和600μmol/LOA组OD值呈剂量依赖性下降,分别为空白对照组的87.0%、75.7%、64.4%和56.8%(P0.05)。CCK-8检测检测显示0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及100ug/ml LPS组OD值呈剂量依赖性下降,分别为空白对照组的86.7%、75.4%、48.9%和44.0%(P0.05)。3.ELISA检测上清液中SP-B表达:ELISA法检测发现SP-B表达量随300、400、500和600μmol/LOA组呈剂量依赖性上升,分别为空白对照组的145.5%、187.4%、223.9%和235.3%(P0.05),,且符合S曲线分布(R=1.00)。除600μmol/LOA组外,各组组间两两t检验比较,差异有统计学意义(P0.05)。ELISA法检测发现SP-B表达量随0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml及100ug/ml LPS组呈剂量依赖性上升,分别为空白对照组的102.7%、124.2%、152.5%和157.2%(P0.05)。部分组间两两t检验比较,差异有统计学意义(P0.05)。4.Western Blot检测SP-B分泌Western Blot检测表明43KD SP-B表达量随OA和LPS浓度升高逐步降低,43KD为完整Pro SP-B片段。结论:在模拟ALI实验中,随着细胞逐步破坏,SP-B在膜中的构象受到较大影响,胞内的SP-B逐步释放到胞外。OA对A549细胞损伤呈剂量依赖性上升,浓度越高,SP-B释放胞外越多,SP-B分泌越少,可以为ALI的体外模型研究提供一定的参考价值。
【关键词】：急性肺损伤 OA干预 LPS干预 肺表面活性物质B 定量研究
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563
【目录】：

• 缩略语表4-5
• Abstract5-8
• 中文摘要8-10
• 1. 前言10-12
• 2. 材料与方法12-22
• 3. 实验结果22-28
• 4. 讨论28-31
• 全文结论31-32
• 参考文献32-36
• 文献综述 急性肺损伤不同方式致伤动物模型的研究进展36-45
• 参考文献41-45
• 攻读学位期间的研究成果45-46
• 致谢46

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本文编号：844474