IL31与特发性肺纤维化信号转导机制研究

发布时间：2017-09-20 20:12

  本文关键词：IL31与特发性肺纤维化信号转导机制研究

  更多相关文章： 特发性肺纤维化 地塞米松 博来霉素 羟基脯氨酸 TGF-β1 IL-31 Smad3 JAKs/STATs

【摘要】：目的：在特发性肺纤维化(IPF)过程中,起主要作用的TGF-β在炎症部位活性增强,使成纤维细胞大量增殖,导致严重肺纤维化,TGF-β通过Smads蛋白的信号转导及调控发挥作用。而Smad-3是介导TGF-β诱导肺纤维化的关键分子,其通过调节靶基因而影响IL-6家族特别是IL-31的表达,进一步影响JAKs/STATs通路,从而引起肺纤维化。这是肺纤维化可能的机制。因此,本项目旨在利用体外培养细胞及BLM诱导小鼠肺纤维化模型,得到TGF-β1-Smad-3-IL-31-JAKs/STATs这条通路,研究这条通路是肺纤维化的可能作用机制,以对肺纤维化的靶向治疗提供一定的线索。 方法：将75只小鼠按随机数字表法分为3组。其中二组为博来霉素诱导肺纤维化模型组(气管内注射BLM5mg/kg0.1mL),分别为单纯造模组(BLM组,25只)、地塞米松治疗组(DXM组,25只)、每组25只；造模后1天,地塞米松组小鼠腹腔注射DXM5mg/kg1(0.1mL),每天1次,连续28天。另1组为正常对照组(NC组,25只)。给药第3、7、14、21、28天每组分别各处死5只小鼠。取肺组织行常规组织病理学观察；免疫组化检测肺组织中TGF-β1、Smad-3含量;RT-PCR法检测IL-31、STAT-1mRNA的表达量；Western blot测STAT-1蛋白含量；染色质免疫共沉淀(CHIP)实验检测Smad-2/3与IL-31启动子之间的结合联系。同时制得原代肺成纤维细胞,待培养3代后,抑制TGF-β表达,而对TGF-β表达的抑制,会下调Smad-3、IL-31的表达水平。对IL-31表达的降低,则会下调STAT-1的表达水平。同时查看肺成纤维细胞的形态,肺成纤维细胞的增殖特征,肺成纤维细胞的胶原合成；检测肺组织中羟基脯氨酸(HYP)含量。 结果： (1)对小鼠肺初步肉眼观察和对肺组织病理学的观察,可发现由于BLM的诱导作用,BLM组小鼠的肺组织根据时间先后顺序出现由3天时的轻度肺泡炎到14天时纤维化的动态改变。DXM组也呈现类似的病理改变过程,但其程度较BLM组轻,但是,对比NC组,其程度却明显加重。NC组病理变化基本未见,没有明显的肺泡炎和纤维化改变。 (2) TGF-β1在NC组肺组织有弱表达,在BLM组7天-14天表达达高峰,有统计学意义(p0.01)。28天TGF-β1表达明显降低。DXM组7天-14天后的TGF-β1明显低于BLM组,地塞米松能够明显降低TGF-β1的表达。 BLM组肺组织Smad3表达增强,第7天时明显高于NC组,随后下降,但直至第28天时BLM组中Smad3的表达仍明显高于NC组。DXM组小鼠各时间点肺组织Smad3表达水平均明显低于BLM组。 (3)跟NC组相比,BLM组的IL-31及STAT-1mRNA从第7天开始升高,第14天达到高峰,后逐渐下降,但到28天仍高于NC组。有明显的统计学意义(p0.05)。 DXM组小鼠各时间点肺组织IL-31及STAT-1mRNA表达水平明显低于实验组。 经Western blot法检测STAT-1蛋白发现NC组小鼠肺内仅有少量STAT-1蛋白表达。BLM组小鼠的病变早期(第7天),肺组织中的STAT-1蛋白表达水平即增高,且随时间延长呈增高趋势,到第14天时达到高峰,第28天下降,差异有统计学意义(P0.05)。DXM组也呈现类似的趋势,但比BLM组的表达明显减轻,有显著的统计学意义(P0.05)。 (4)用抗Smad-3抗体进行免疫沉淀蛋白质DNA交联复合物,用RT-PCR检测IL-31启动子,发现与NC组相比,BLM组的IL-31启动子明显增高。第21天达到高峰,到28天仍明显增高,有统计学意义(P0.05)。 (5)对TGF-β表达的抑制,则会下调Smad-3、IL-31的表达水平。 (6)而对IL-31表达的降低,则会下调STAT-1的表达水平。 (7)BLM组与NC对照组相比,肺组织中羟基脯氨酸含量第14天开始上升,第28天达到峰值(p0.01)；DXM治疗组HYP含量于14-28天有明显下降(p0.05)。 结论： 我们利用免疫组织化学、Western blot. RT-PCR及CHIP等方法对博来霉素诱导的肺纤维化模型中TGF-β1、Smad-3、IL-31、STAT-1的表达水平进行了检测,发现这四者在一定程度上,具有表达水平共同升高或者降低的趋势,而CHIP的使用,则进一步证明了前人并没有证明的Smad-3通过与Il-31的结合而诱发下游JAK/STAT通路激活的作用。
【关键词】：特发性肺纤维化 地塞米松 博来霉素 羟基脯氨酸 TGF-β1 IL-31 Smad3 JAKs/STATs
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-18
• 注释表18-20
• 第一章 绪论20-36
• 1.1 特发性肺纤维化概述20-21
• 1.2 特发性肺纤维化发病机制研究进展21-26
• 1.2.1 肺泡上皮细胞受损21-22
• 1.2.2 成纤维细胞增殖和胶原产生细胞的聚集22
• 1.2.3 上皮-间质转化22-23
• 1.2.4 细胞调亡23
• 1.2.5 细胞因子的作用23-25
• 1.2.6 凝血—纤溶系统25
• 1.2.7 Wnt信号途径25-26
• 1.2.8 Rho/Rho激酶信号通路26
• 1.3 特发性肺纤维化临床治疗进展26-29
• 1.3.1 糖皮质激素治疗26-27
• 1.3.2 细胞毒性药物27
• 1.3.3 针对细胞氧化/抗氧化失衡的抗氧化和自由基治疗27-28
• 1.3.4 IPF的抗凝治疗28
• 1.3.5 抗纤维化28
• 1.3.6 肺移植28-29
• 1.3.7 其它29
• 1.4 特发性肺纤维化与TGF-β信号通路的关系29-33
• 1.5 IPF动物模型33-34
• 1.6 本课题研究的目的及意义34-35
• 1.7 技术路线35-36
• 第二章 博来霉素诱导肺纤维化模型制备及组织形态学观察36-47
• 2.1 材料与方法36-42
• 2.1.1 材料36-38
• 2.1.2 方法38-41
• 2.1.3 统计学方法41-42
• 2.2 结果42-45
• 2.2.1 肉眼初步对组织进行观察42-44
• 2.2.2 肺泡炎及肺纤维化评分结果44-45
• 2.3 讨论45-47
• 第三章 免疫组化检测TGF-β1与Smad3的表达水平47-57
• 3.1 材料与方法47-52
• 3.1.1 材料47-49
• 3.1.2 方法49-51
• 3.1.3 统计学方法51-52
• 3.2 结果52-54
• 3.2.1 免疫组织化学技术检测肺组织中TGF-β1表达52-53
• 3.2.2 免疫组织化学方法检测肺组织中Smad3蛋白的表达水平53-54
• 3.3 讨论54-57
• 第四章 IL-31、STAT-1的表达水平检测57-72
• 4.1 材料与方法57-67
• 4.1.1 材料57-59
• 4.1.2 方法59-66
• 4.1.3 统计学方法66-67
• 4.2 结果67-69
• 4.2.1 IL-31的表达水平67-68
• 4.2.2 小鼠肺组织STAT-1蛋白表达水平68-69
• 4.3 讨论69-72
• 第五章 染色质共沉淀法检测Smad-3与IL-31启动子的结合72-78
• 5.1 材料与方法72-75
• 5.1.1 材料72-74
• 5.1.2 方法74-75
• 5.1.3 统计学方法75
• 5.2 结果75-76
• 5.3 讨论76-78
• 第六章 TGF-β通路抑制剂SB431542处理细胞影响Smad-3的表达78-83
• 6.1 材料与方法78-81
• 6.1.1 材料78-80
• 6.1.2 方法80-81
• 6.2 结果81-82
• 6.3 讨论82-83
• 第七章 敲减IL-31对STAT-1的表达影响83-87
• 7.1 材料与方法83-85
• 7.1.1 材料83-85
• 7.1.2 方法85
• 7.2 结果85-86
• 7.3 讨论86-87
• 第八章 地塞米松对细胞因子及羟脯氨酸的影响87-92
• 8.1 材料与方法87-89
• 8.1.1 材料87-88
• 8.1.2 方法88-89
• 8.1.3 统计学方法89
• 8.2 结果89-90
• 8.3 讨论90-92
• 第九章 主要结论与展望92-94
• 9.1 结论92
• 9.2 创新点92-93
• 9.3 展望93-94
• 参考文献94-113
• 综述113-118
• 参考文献116-118
• 攻读博士学位期间发表论文118-119
• 致谢119

【共引文献】

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