microRNA调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的作用机制研究

发布时间：2017-09-25 21:02

  本文关键词：microRNA调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的作用机制研究

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【摘要】：研究背景近年来,侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillus,IPA)发病率持续增高,这与人平均寿命延长、肿瘤化疗、器官移植以及广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂的应用密切相关。目前公认引起IPA的发病危险因素是粒细胞缺乏,但越来越多的证据表明在非粒缺患者,如COPD患者,也存在发生IPA的高风险。本课题组前期研究发现我院COPD患者IPA发病率为3.9%,死亡率高达48%。目前对COPD患者曲霉易感性增加原因探究成为研究热点,呼吸系统防御功能受损是重要原因之一。肺泡巨噬细胞的固有免疫功能在曲霉防御中发挥重要作用,烟雾暴露对肺泡巨噬细胞免疫功能影响已被验证,但具体分子机制仍在研究中。肺泡巨噬细胞通过模式识别受体(pathogen recognition receptors,PRRs)识别、黏附曲霉孢子,并启动免疫反应及炎症应答。TLR2是最重要PRRs之一,能识别曲霉细胞壁多种成分,从而介导NF-κB活化,导致炎症因子的释放。本课题组前期研究发现,与正常大鼠相比较,基础状态下COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达偏低,接种曲霉孢子后其上调明显滞后。进一步分析TLR2mRNA表达变化时发现,COPD大鼠接种曲霉孢子后,肺泡巨噬细胞TLR2mRNA表达增加反而比对照组更明显。该研究说明,烟雾暴露并未影响COPD大鼠TLR2基因转录,但其翻译过程出现异常,导致TLR2不能正常表达,从而损伤其固有免疫功能。miRAN是一种广泛存在于真核生物中非编码单链小分子RNA,它们能够与靶mRNA的3'-UTR区碱基互补配对,使其翻译受到抑制,从而在转录后水平对生物体内基因表达进行精细调节。miRNA表达作为细胞接受到外源或内源的信号后的一种早期反应,在免疫细胞的发育以及整个免疫应答过程中发挥着极为重要的调控作用。目前已有多项研究证实,吸烟会影响肺组织miRNA表达。因此我们推测,COPD患者由于长期烟雾刺激,导致肺泡巨噬细胞异常炎症反应,引起某些miRNA表达变化,以反馈或负反馈方式调控炎症反应。其中有些miRNA可能直接参与调控TLR2受体表达及相关信号通路的活化,损伤巨噬细胞的固有免疫功能。在本研究中,我们利用miRNA芯片技术测定COPD大鼠与正常大鼠肺泡巨噬细胞中差异表达的miRNA,通过生物信息学方法筛选可能参与TLR2受体调控的目标miRNA,采用双荧光素酶的方法判断两者是否特异性结合,最后进行miRNA对COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达影响调控机制研究,探索吸烟影响肺泡巨噬细胞免疫功能的分子机理。第一章COPD大鼠肺泡巨噬细胞差异表达的miRNA筛选目的：利用miRNA芯片技术筛查COPD大鼠与正常大鼠肺泡巨噬细胞中差异表达的miRNA,为下一步确定调控TLR2受体的miRNA提供线索。方法：60只雌性wistar大鼠随机分为对照组、模型组。模型组采用单纯熏香烟,1小时／次,2次／天,连续3月的方法造模。采用肺部CT、肺功能、肺组织病理学进行模型鉴定。肺泡巨噬细胞鉴定采用瑞氏染色与免疫荧光染色。收集COPD大鼠和正常大鼠肺泡巨噬细胞共3对。分离肺泡巨噬细胞提取总RNA,使用分光光度计测定RNA质量,凝胶电泳行RNA完整性鉴定。使用丹麦Exiqon公司试剂盒进行miRNA标记、芯片杂交、行微阵列基因芯片分析,比较两组大鼠肺泡巨噬细胞miRNAs表达差异。结果：模型组胸部CT、肺功能、肺病理均符合COPD表现。肺泡巨噬细胞瑞氏染色见细胞呈圆形或椭圆形,核大深染。CD68行免疫荧光染色见肺泡巨噬细胞荧光染色呈阳性。与对照组相比,模型组let-7b-3p与miR-675-5p显著下调；miR-200b-3p、miR-665、miR-344b-1-3p、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-99b-5p、 miR-129-1-3p、iR-3557-5p、miR-331-5p、iR-493-5p、miR-200a-3p11种miRNAs显著上调。结论：1.单纯烟熏法能成功复制COPD大鼠模型；2.COPD大鼠肺泡巨噬细胞与正常对照组之间存在明显差异的miRNA表达。其中11个miRNA表达上调,2个miRNA表达下调。需要做进一步研究来探索其功能。第二章 调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的miRNA预测目的：筛查调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的miRNA。方法：采用mirbase,miranda和mirdb三个数据库,分别对第一章获得的13个miRNA进行靶基因预测,评估获得的靶基因是否有TLR2。其次通过生物信息学方法为TLR2反向预测所有相关miRNA,最后通过NCBI网站检索与TLR2相关的miRNA文献。将后两者结果与芯片发现的所有miRNA(含无统计学差异的miRNA)进行比对。采用以上三种途径获得调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体的所有miRNA。最后为排除基因芯片假阳性或假阴性可能,采用实时荧光定量PCR (QPCR)的方法对其进行验证,并对最后筛选的阳性结果,利用DAVID6.7系统进行靶基因Gene ontology(GO)及KEGG pathway分析。结果：采用mirbase,miranda和mirdb三个数据库进行靶基因预测,共计表达12368个靶基因。仅miRDB数据库预测miR-344b-1-3P的靶基因为TLR2。采用miRWalk数据库,反向预测与TLR2基因有序列互补关系的miRNA,共找到13个miRNA,再将其与芯片发现的所有miRNA进行比对,结果提示Rno-miR-124-3P, rno-miR-363-5P,rno-miR-9a-3p在芯片中有表达。经NCBI检索,发现miR-125, miR-19a/b,miR-146a的靶基因为TLR2。再将其与芯片发现的所有miRNA进行比对,结果提示rno-miR-125b-5p、rno-miR-19b-3p、miR-146a-5p在芯片中有表达。扩大样本量,对经以上三种方式发现的与TLR2相关的的7个miRNA进行qPCR验证。7个miRNA中rno-miR344b-1-3p、rno-miR-125b-5p、miR-146a-5p差异有统计学意义。7个miRNA芯片与qPCR表达趋势一致。miR-344b-1-3p表达在芯片及qPCR结果中表达均上调且均有统计学差异,为首次报道。靶基因KEGG信号通路富集分析表明,miR-344b-1-3p的靶基因与TLR信号通路有关。结论：1.实时荧光定量PCR结果与芯片结果一致,基因芯片结果可靠；2.筛选miR-344b-1-3p调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达；3.miR-344b-1-3p靶基因pathway分析可见与TLR信号通路有关。第三章双荧光素酶双报告系统验证miR-344b-1-3p对肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的调控目的：验证miR-344b-1-3p是否直接作用于TLR2-3'UTR。方法：通过在线分析软件对TLR2基因的miR-344b-1-3p结合位点做生物信息学分析,通过长引物序列拼接及点突变合成全序列TLR2-3'UTR。目的基因TLR2-3'UTR分别被正向及反向亚克隆至海肾萤光素酶翻译终止密码子下游多克隆位点,构建含有TLR2-3'UTR区域融合报告基因质粒,并进行重组质粒测序鉴定。将质粒转染至293细胞进行双荧光素酶活性检测。结果：成功构建含TLR2-3'UTR区重组质粒。双荧光素酶报告系统检测提示与mimics对照组相比较,过表达的miRNA344b-1-3p mimics可显著降低TLR2-3'UTR的报告基因活性(P=0.000481637),而niRNA344b-1-3p inhibitor可显著升高TLR2-3'UTR报告基因活性(P=0.000428327)。初步确认miR-344b-1-3p调控TLR2基因。结论：miR-344b-1-3p特异性调控TLR2。第四章miR-344b-1-3p对大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达及信号通路影响目的：探讨miR344b-1-3p对大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达及对信号通路和释放炎症因子的影响方法：1.利用香烟烟雾提取物刺激NR8383细胞,试验分为4组：A：NR8383细胞+CSE(5%)；B：NR8383细胞+CSE(10%)：C：NR8383细胞+CSE(15%)；D：空白对照组：NR8383细胞。造膜24h后进行流式细胞凋亡率检测,采用qPCR方法检测细胞中miRNA-344b-1-3P的表达。2.构建大鼠miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒表达载体,将miR-344b-1-3p inhibitor漫病毒转染NR8383细胞。3.进行miR-344b-1-3P对大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达及信号通路影响研究。实验分为3组：A：NR8383细胞+10% CSE+miRNA慢病毒+Pam3CSK4; B:NR8383细胞+10%CSE+miRNA空病毒+Pam3CSK4; C:NR8383细胞+10%CSE+Pam3CSK4.先采用10% CSE刺激NR8383细胞24小时,然后将miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒或者空病毒转染NR8383细胞24小时,最后采用1ug/mlPam3CSK4刺激细胞1小时。收集细胞,采用流式细胞法检测TLR2的表达；提取RNA采用QPCR检测TLR2 mRNA的表达；收集蛋白采用WB检测IRAK-1、IκBα、ERK的表达；收集上清液测定TNF-α、IL-1β、MIP-2、IL-10表达水平。结果：1.空白对照组(NR8383细胞)凋亡率较低,随着CSE浓度的增加,凋亡率呈升高的趋势。两两相比较有显著性差异(P0.05)。QPCR结果显示随着CSE浓度的增加,miR-344b-1-3p表达增加,但是CSE浓度增加至15%时,miRNA表达量与10%CSE浓度结果无统计学意义。2.经测序验证,慢病毒载体构建成功。3.将miR-344b-1-3p inhibitor慢病毒转染CSE刺激的NR8383细胞,经Pam3CSK4刺激后,流式细胞检测A组细胞表面LTR2受体表达较B、C组增高。4. Western blotting检测结果显示A组的TLR2相关配体蛋白pIKBα、pIRAK-1、pERK表达较B、C组增高。用各组条带的配体蛋白灰度值比各组的GAPDH灰度值得到配体蛋白相对表达量,可见A组配体蛋白相对表达量高于B组及C组。5.3组培养上清液的浓度均增高。但A组TNF-α、IL-1β、MIP-2较B、C组高,差异有统计学意义(P0.05),但IL-10表达较对照组稍降低,差异无统计学意义(P0.05)。结论：1.CSE刺激NR8383细胞导致miR-344b-1-3p表达增高；2.miR344b-1-3p能调控TLR2表达及其相关信号通路,并引发炎症因子的分泌。
【关键词】：肺疾病 阻塞性 慢性 微小RNA 大鼠 实时荧光定量PCR 微小RNA 大鼠 miR-344b-1-3p TLR2 双荧光素酶 miR-344b-1-3p NR8383 TLR2
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.9;R519
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-25
• 参考文献23-25
• 第一章 COPD大鼠肺泡巨噬细胞差异表达的microRNA筛选25-47
• 引言25-26
• 1 实验材料26-28
• 2 实验方法28-33
• 3 结果33-41
• 4 讨论41-44
• 参考文献44-47
• 第二章 调控COPD大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的microRNA预测47-69
• 引言47-48
• 1 实验材料48-49
• 2 实验方法49-52
• 3 结果52-61
• 4 讨论61-66
• 参考文献66-69
• 第三部分 荧光素酶双报告基因检测系统验证miR-344b-1-3p对肺泡巨噬细胞TLR2受体表达的调控69-90
• 引言69-70
• 1 实验材料70-74
• 2 实验方法74-82
• 3 结果82-85
• 4 讨论85-88
• 参考文献88-90
• 第四部分 microRNA-344b-1-3p对大鼠肺泡巨噬细胞TLR2受体表达及信号通路的影响90-124
• 引言90-91
• 1 实验材料91-93
• 2 实验方法93-104
• 3 结果104-111
• 4 讨论111-119
• 参考文献119-124
• 全文总结124-126
• 成果126-127
• 致谢127-129

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘小荣;张笠;王勇平;;实时荧光定量PCR技术的理论研究及其医学应用[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年02期

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本文编号：919524