CD39在过敏性哮喘的作用及其机制研究

发布时间：2017-09-30 16:14

  本文关键词：CD39在过敏性哮喘的作用及其机制研究

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【摘要】：目的：已有研究证实胞外ATP-嘌呤受体信号通路参与过敏性哮喘的病理生理过程,ATP可被胞外核苷酸酶ENTPDase-1/CD39水解。在小鼠,CD39主要表达于CD4+Foxp3+调节性T细胞。因此,本研究探讨了CD39是否参与小鼠过敏性哮喘的病理生理过程及CD39是否介导了CD4+Foxp3+调节性T细胞发挥抑制小鼠过敏性哮喘的作用。 方法：1)采用C57BL/6雌性小鼠(6-8周龄)建立鸡卵清蛋白(OVA)致敏和激发的过敏性哮喘模型,以OVA非致敏的同背景雌性小鼠作为对照,于最后一次激发的48小时,小鼠被安乐死,免疫组织化学法检测CD39在肺组织的定位,实时定量聚合酶链反应(qPCR)及蛋白免疫印迹法定量肺组织内CD39的核酸及蛋白水平。2)采用C57BL/6雌性小鼠建立OVA致敏和激发的过敏性哮喘模型,于激发前给予不同的处理即CD39抑制剂(ARL67156)、三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)+ARL67156及PBS,并以OVA非致敏的同背景雌性小鼠作为对照,于最后一次激发的48小时,处理小鼠并完成气道炎症及气道高反应性的测定。具体如下：苏木精-伊红染色(HE)及过碘酸-雪夫氏染色(PAS)评价肺组织内嗜酸性粒细胞炎症及支气管上皮杯状细胞增生；血球计数板计数支气管肺泡灌洗液的总细胞,细胞离心制备细胞涂片,瑞氏-姬姆萨染色并计数分类细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中OVA特异性免疫球蛋白(IgE)及支气管肺泡灌洗液上清中细胞因子(IL-4,IL-5,IL-13,IL-17,及IFN-γ)水平；qPCR方法测定肺组织内转录因子(GATA3、RORγt)及嘌呤受体(P2Y2、P2Y6)核酸水平；气道高反应性通过有创法测定气道阻力和肺动态顺应性。3)选取CD39基因敲除小鼠及同背景的野生型C57BL/6雌性小鼠,OVA致敏和激发诱导过敏性哮喘模型。取肺组织,HE及PAS染色观察气道炎症及杯状细胞增生粘液分泌情况；计数支气管肺泡灌洗液的细胞总数,细胞离心后行瑞氏-姬姆萨染色后计数炎性细胞数,ELISA法测定支气管肺泡灌洗液上清中Th2及Thl7相关细胞因子水平。4)选取野生型和CD39基因敲除型的FOXP3-GFP-KI的C57BL/6雄性小鼠(6-14周龄),结合磁珠及流式细胞术方法分选小鼠脾脏CD4+GFP+的调节性T细胞。选取C57BL/6雌性小鼠建立OVA致敏和激发的过敏性哮喘模型,于OVA第一次激发前1小时,经尾静脉注入分选的CD39+CD4+GFP+和CD39-CD4+GFP+的T细胞。取对照组和哮喘小鼠脾脏单个核细胞,流式细胞术测定脾脏单个核细胞中CD4+Foxp3+调节性T细胞比例；取肺组织,HE及PAS染色观察气道炎症及杯状细胞增生粘液分泌情况。进行支气管肺泡灌洗,计数灌洗液的细胞总数,细胞离心后行瑞氏-姬姆萨染色并计数不同种类的炎性细胞数,ELISA法测定支气管肺泡灌洗液上清中Th2及Th17相关细胞因子水平；气道高反应性通过有创法测定气道阻力和肺动态顺应性。5)体外共培养调节性T细胞与效应性T细胞,并给与腺苷A2A受体拮抗剂,培养三天后收集上清,ELISA法测定细胞因子水平。 结果：1)CD39在肺组织主要定位于血管内皮细胞及免疫炎性细胞,及少量表达于支气管上皮细胞；过敏性哮喘小鼠肺组织内CD39的表达明显下降。2)CD39抑制剂ARL67156加重过敏性哮喘的主要特征,具体表现：肺组织内嗜酸性粒细胞增多、气道杯状细胞增生明显及粘液分泌增加、Th2和Th17相关的细胞因子水平增加及气道反应性增高；气管内给予三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase预处理可降低ARL67156加重的上述炎症指标。3)与野生型哮喘小鼠相比,CD39基因敲除小鼠表现出加重的气道炎症。4)过敏性哮喘小鼠脾单个核细胞中CD4+Foxp3+调节性T细胞数量明显减少。外源性补充CD4+Foxp3+调节性T细胞可抑制过敏性哮喘小鼠的气道炎症及降低气道高反应性；与CD39"CD4+Foxp3+调节性T细胞相比,CD39+CD4+Foxp3+调节性T细胞表现出更强的抑制气道炎症功能。5)体外共培养结果示CD39+CD4+Foxp3+调节性T细胞除可抑制Th2细胞分泌的细胞因子外,还可抑制IL-17产生。 结论：1)过敏性哮喘小鼠肺组织内的CD39表达量不足。2)CD39抑制剂可加重过敏性哮喘小鼠的气道炎症,这可能与哮喘时嘌呤受体(P2R)过度表达有关。3)CD39介导了CD4+Foxp3+调节性T细胞发挥抑制过敏性哮喘气道炎症和降低气道高反应性的作用,主要是通过抑制IL-17产生发挥抑制气道炎症作用。
【关键词】：过敏性哮喘 CD39 胞外ATP 调节性T细胞
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 论文创新点6-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 1 前言12-16
• 第一部分 CD39在小鼠过敏性哮喘中的作用16-48
• 2 材料和方法16-34
• 3 研究结果34-44
• 4 讨论44-48
• 第二部分 CD4~+CD39~+Foxp~(3+)调节性T细胞减轻过敏性哮喘小鼠的气道炎症48-62
• 5 材料和方法48-51
• 6 研究结果51-59
• 7 讨论59-62
• 结论62-63
• 参考文献63-70
• 综述 ENTPDasel/CD39免疫调节的研究进展70-85
• 参考文献77-85
• 攻博期间发表的相关论文成果85-86
• 致谢86

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本文编号：949162