基于盐皮质激素受体中介的单核巨噬细胞表型调控对实验性肺纤维化的干预研究

发布时间：2017-10-04 00:34

  本文关键词：基于盐皮质激素受体中介的单核巨噬细胞表型调控对实验性肺纤维化的干预研究

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【摘要】：目的：特发性肺纤维化（IPF）是一种病因未明的、慢性致死性的且病程不可逆的纤维化疾病，由于其发病过程的自身特点，很难找到有效的预防和治疗方法。IPF的发病机制仍不清楚，目前主要观点包括：炎症和免疫机制、肺泡上皮细胞损伤及异常的修复机制、氧化应激及其信号途径、促凝机制等，其中炎症反应的异常调节在肺纤维化的发生发展中仍发挥重要的作用。单核巨噬细胞的异质性，亦即具有不同功能的亚群，是近年来免疫相关疾病研究的热点之一，外周血单核细胞亚群和肺巨噬细胞表型偏移失衡与肺纤维化病理进展关系密切。盐皮质激素受体（MR）除了存在于心血管系统及肾脏靶细胞外，在单核巨噬细胞也有表达，研究发现，盐皮质激素受体参与了单核巨噬细胞表型的偏移调节。脂质体（liposome）能够特异性靶向巨噬细胞，载药脂质体是一种针对单核吞噬细胞系统有效的给药方式。 本研究首先观察博莱霉素诱导小鼠实验性肺纤维化模型中，循环单核细胞、肺泡巨噬细胞及肺间质巨噬细胞不同亚群在实验性肺纤维化小鼠不同病理生理时期的动态变化特点，探讨循环中、肺泡腔及肺间质来源的单核巨噬细胞系统表型偏移与肺组织炎症和纤维化的关系。然后，采用MR阻断剂螺内酯脂质体干预后分别检测循环单核细胞和肺组织巨噬细胞不同亚群的变化，及其对博莱霉素诱导的早期炎症及后期纤维化的作用。 方法：100只雄性C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水组（NS）、博莱霉素组（BLM），乙醚轻度麻醉后经口咽吸入法分别给予40μL无菌生理盐水及相同体积博莱霉素A5（2.5mg/kg），在造模后第1d、3d、7d、14d及21d麻醉后处死小鼠，未灌洗组小鼠左肺用于病理学检测，分别用炎症评分（Inflammation score, IS），胶原容积分数（Collagen volume fraction,CVF）和α-SMA表达指标表示各组小鼠肺组织炎症及纤维化程度；常规方法进行支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid, BALF）细胞计数、分类计数及流式细胞术分析，酶联免疫吸附法（ELISA）测定BALF上清液中炎症因子的含量；荧光定量PCR法检测各组小鼠肺组织细胞因子及胶原的mRNA表达量，氯胺T法检测肺组织羟脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）含量，流式细胞术检测循环单核细胞、肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophage, AMφ）及肺间质巨噬细胞亚群（Interstitial macrophage, IMφ）的变化。 为了检测阻断盐皮质激素受体对博莱霉素诱导的实验性肺纤维化的干预作用，雄性C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水组（NS）、博莱霉素组（BLM）、博莱霉素加空白脂质体组（BLM+LC）、博莱霉素加螺内酯脂质体组（BLM+LS）及博莱霉素加普通螺内酯组（BLM+SP），采用相同的博莱霉素给药途径和剂量造模，术后当天开始至第21d，后3组小鼠分别给予空白脂质体、螺内酯脂质体（20mg/kg）及相同剂量的普通螺内酯灌胃处理，取材时间点及检测方法同前。 结果：HE染色显示，BLM组小鼠肺组织第3d可见明显的支气管周围及间质炎症细胞浸润、肺泡壁增宽等炎症表现。造模后第1d至第21d，与NS组相比，BLM组小鼠肺组织IS明显增高，差异均有统计学意义，其中第7d达到峰值后呈下降趋势。博莱霉素处理后第7d，BLM+LS组及BLM+SP组炎症程度分别较各自对照组明显降低（均P 0.05），不同剂型螺内酯组之间无差异；与NS组相比，BLM组小鼠CVF在第7d增高，，第14d继续增加，至第21d肺CVF达到最高。不同剂型螺内酯干预第21d纤维化指数较各自对照组降低（均P 0.05）、α-SMA阳性区域下降（均P 0.01），螺内酯脂质体组平均水平略低于普通螺内酯组。与病理检测一致，BLM组小鼠HYP含量第7d至第21d均高于NS组，螺内酯脂质体及普通螺内酯干预第21d，HYP含量较各自对照组降低（均P 0.05），螺内酯脂质体组HYP平均含量低于普通螺内酯组。 BLM组BALF细胞总数从第3d开始至第21d均较NS组升高（P 0.01），其中第7d达到最高。巨噬细胞数与细胞总数变化趋势相同，中性粒细胞数量第1d至第7d显著高于NS组（均P 0.01），第14d后降低与NS组无差异。BLM组淋巴细胞第3d至第21d均高于NS组，其中第14d淋巴细胞数达到峰值。在炎症程度最高的第7d，与各自对照组相比，BLM+LS组及BLM+SP组均降低炎症细胞总数及各组份细胞数，差异有统计学意义。 与NS组相比，BLM组小鼠在急性炎症期（第1,3,7d）肺组织IL-1β、CCL2和TNF-α的mRNA表达水平明显升高，纤维化进展期（第14，21d）Col I、Col III的表达水平显著升高（均P 0.01）。在博莱霉素诱导的炎症期，螺内酯脂质体明显下调了IL-1β、TNF-α及CCL2的mRNA表达水平，而普通螺内酯干预第7d，CCL2的表达水平与其对照组相比变化无统计学意义。博莱霉素处理组第3d精氨酸酶-1（Arg-1）的mRNA表达水平较生理盐水组升高（P 0.05），第7dArg-1表达进一步升高，不同剂型螺内酯干预下调了Arg-1的表达，差异有统计学意义。与荧光定量PCR检测结果一致，ELISA结果表明，螺内酯脂质体降低了博莱霉素诱导的炎症期BALF上清液中IL-1β、CCL2及TNF-α的含量。与其对照组相比，普通螺内酯干预第7d TNF-α含量降低无统计学意义。 与NS组相比，博莱霉素干预后循环单核细胞表面Ly6C分子表达呈现动态变化。Ly6Chi单核细胞亚群（经典型）在博莱霉素作用后第1d比例迅速升高（P 0.01），第3d达到高峰，而后逐渐下降直至第21d，Ly6Clo单核细胞亚群（非经典型）比例变化与Ly6Chi亚群变化趋势相反；不同时间点肺泡灌洗液中巨噬细胞主要为M1表型，然而博莱霉素干预后第3d选择性激活肺泡巨噬细胞（Alternatively activated AMφ, M2表型）比例升高，第14d达到高峰后呈现降低趋势。经酶解法获得的肺间质巨噬细胞在博莱霉素干预后第1d至第14d表型无明显变化，而第21d选择性激活的间质巨噬细胞（M2表型IMφ）比例升高（P 0.01）。相关性分析结果表明，Ly6Chi单核细胞亚群比例与肺炎症反应呈明显正相关，M2型AMφ比例与胶原沉积呈明显正相关；相应的Ly6Clo单核细胞及M1型AMφ分别与炎症和纤维化指标呈负相关。然而，间质巨噬细胞与以上病理学指标无统计学关联。与对照组相比，螺内酯脂质体干预第3d循环Ly6Chi单核细胞亚群比例明显降低（P 0.01），第14d明显减弱了博莱霉素诱导的M2表型AMφ升高趋势（P 0.05）。螺内酯普通剂型与螺内酯脂质体作用一致，两者之间差异无统计学意义。 结论：本研究阐明了博莱霉素诱导的C57BL/6J小鼠肺损伤及纤维化模型中，循环单核细胞、AMφ及IMφ不同亚群的动态变化。即博莱霉素作用后循环Ly6Chi单核细胞亚群比例迅速升高，之后伴随着M2表型肺泡巨噬细胞比例的升高。二者分别与肺炎症反应和纤维化程度呈明显正相关。经酶解法制备的间质巨噬细胞表型变化不明显。阻断盐皮质激素受体减轻了博莱霉素诱导的早期炎症反应及后期纤维化程度，部分是通过降低炎症早期快速升高的Ly6Chi单核细胞数量及抑制肺泡巨噬细胞选择性激活（向M2表型偏移）实现的。
【关键词】：肺纤维化 博莱霉素 单核巨噬细胞表型 螺内酯 盐皮质激素受体 脂质体
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 引言13-15
• 第一部分 博莱霉素诱导小鼠实验性肺纤维化模型中循环单核细胞和肺巨噬细胞表型的动态演变15-47
• 前言15
• 材料与方法15-29
• 结果29-32
• 附图32-39
• 附表39-40
• 讨论40-41
• 小结41-42
• 参考文献42-47
• 第二部分 靶向性阻断盐皮质激素受体通过调节单核巨噬细胞表型偏移减轻小鼠实验性肺纤维化47-73
• 前言47-48
• 材料与方法48-55
• 结果55-59
• 附图59-65
• 附表65-66
• 讨论66-68
• 小结68
• 参考文献68-73
• 综述 单核巨噬细胞在肺纤维化发生发展中的作用73-87
• 参考文献80-87
• 致谢87-88
• 个人简历88

【参考文献】

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1 ;Early lung injury contributes to lung fibrosis via AT1 receptor in rats[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年02期

本文编号：967666