ATF3在LPS诱导的急性肺损伤炎症中的作用及机制研究

发布时间：2017-10-08 04:00

  本文关键词：ATF3在LPS诱导的急性肺损伤炎症中的作用及机制研究

  更多相关文章： 急性肺损伤 脂多糖 活化转录因子3 TL1A RNA干扰 基因芯片

【摘要】：1.背景和目的急性肺损伤(acute lung injury,ALI),急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是因为各种肺内、外因素所致的以肺泡毛细血管膜弥漫性损伤、严重低氧血症为特征的呼吸危重症,因外其发病机制尚不完全清楚,所以仍有较高的病死率。其中,炎症反应失衡在疾病的发生发展中占有重要地位。由革兰阴性杆菌感染引起的脓毒血症是导致ALI/ARDS的重要病因,而脂多糖(Lipopolysaccharide LPS)作为革兰阴性杆菌的胞壁成分是先天性免疫反应及炎症反应的启动子,是导致ALI/ARDS的重要原因之一。因此,明确LPS导致炎症损伤的发病机制对急性肺损伤的治疗有重要意义。目前已证实,转录活化因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是一应激早期快反应基因,其表达与炎症反应、机体稳态维持、肿瘤发生等密切相关。在多种炎症模型中,ATF3对炎症反应起刹车作用。然而,ATF3在LPS致急性肺损伤中的作用尚不完全清楚。鉴于此,本课题拟通过比较腹腔注射LPS后的野生型小鼠和ATF3敲基因小鼠的各项炎症指标,明确ATF3在LPS致急性肺损伤小鼠模型中的作用;将两组小鼠肺组织通过基因芯片技术寻找其差异基因;并最后通过构建干扰质粒下调ATF3在小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞中的表达,探讨ATF3调控LPS导致炎症反应的可能机制,从而为急性肺损伤的防治提供潜在的新靶点。2.研究方法(1)构建急性肺损伤动物模型,并明确ATF3在动物模型中的表达规律向小鼠进行腹腔注射LPS,注射量为15mg/kg,从而建立急性肺损伤小鼠的动物模型,分别采取RT-PCR以及Western blot的方法,检测ATF3在LPS刺激后的各个时相点,小鼠肺组织中的表达情况,从而明确其表达规律。(2)观察ATF3对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用构建ATF3敲基因小鼠,用Western blot的方法鉴定敲基因小鼠中ATF3的表达缺失,通过比较野生型小鼠和ATF3敲基因小鼠的肺组织病理切片、肺组织湿干比、肺组织中炎症因子的表达水平、肺泡灌洗液蛋白浓度以及7天存活率来评估ATF3对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用。(3)利用基因芯片技术筛选急性肺损伤小鼠中与atf3相关的差异基因同时用lps对c57小鼠及atf3敲基因小鼠进行腹腔注射后2小时,然后提取两组小鼠肺组织的总rna,通过基因芯片技术筛选差异表达基因。再结合文献阅读,最终重点关注tl1a分子,并提出atf3可能是通过下调tl1a的表达实现对急性肺损伤的炎症保护作用这一假说。(4)以小鼠单核巨噬细胞株raw264.7细胞为模型探讨atf3在lps诱导的急性肺损伤中的可能机制用rt-pcr和westernblot的方法比较raw264.7细胞中,atf3在lps刺激后各个时间点的表达变化。构建质粒,用rna干扰的方法下调atf3在raw264.7细胞中的表达,观察atf3对lps诱导的细胞炎症损伤以及信号分子通路tl1a表达的影响;采用sirna双干扰技术同时下调atf3和tl1a在raw264.7细胞中的表达后,通过检测炎症因子il-6的表达变化说明tl1a信号通过在atf3调控lps诱导的急性肺损伤中的作用。3.结果(1)atf3表达于正常小鼠肺组织,lps腹腔注射后,小鼠肺组织内atf3的表达水平明显增加(p0.05),以lps腹腔注射2h时相点达表达高峰,rt-pcr与westernblot的结果趋势一致。(2)将野生型小鼠与atf3敲基因小鼠作为对比,lps腹腔注射以后,atf3敲基因小鼠的肺组织病理损伤加重,肺组织湿干比增加,炎症因子il-6、il-1β、tnf-α表达增加,肺泡灌洗液蛋白浓度增加,小鼠7天存活率显著下降(p0.05)。(3)从基因芯片的结果中找到了atf3敲基因小鼠和野生型小鼠的差异基因tl1a,结合阅读文献,提出了atf3可能通过下调tl1a表达,对lps诱导的急性肺损伤炎症起到调控作用的科学假说。(4)lps刺激后,atf3在raw264.7细胞中的表达上调,表达高峰点在lps处理6h后,下调atf3的表达会增加lps诱导的炎症因子tnf-α和il-6的释放;与lps和ncsirna+lps组相比,atf3sirna组和atf3sirna+lps组raw264.7细胞中tl1a的表达显著增加(p0.05),为进一步证实tl1a信号通路在atf3调控lps诱导的急性肺损伤中的作用,我们同时下调了atf3和tl1a在raw264.7细胞中的表达,与atf3sirna+lps组相比,atf3sirna+tl1asirna组raw264.7细胞中il-6的表达显著降低(p0.05)。4.结论(1)ATF3对LPS诱导的急性肺损伤有保护作用;(2)TL1A信号通路可能参与了ATF3对LPS诱导的急性肺损伤炎症的调控作用。
【关键词】：急性肺损伤 脂多糖 活化转录因子3 TL1A RNA干扰 基因芯片
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 略缩语表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 ATF3对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用13-28
• 2.1 材料与方法13-23
• 2.2 结果23-26
• 2.3 讨论26-27
• 2.4 小结27-28
• 第三章 ATF3对急性肺损伤小鼠保护作用的可能机制28-42
• 第一部分 基因芯片结果28-33
• 3.1.1 材料与方法28-29
• 3.1.2 结果29-31
• 3.1.3 讨论31-32
• 3.1.4 小结32-33
• 第二部分 ATF3在小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7 细胞中的作用和机制研究33-42
• 3.2.1 材料与方法33-36
• 3.2.2 结果36-40
• 3.2.3 讨论40-41
• 3.2.4 小结41-42
• 全文总结42-43
• 参考文献43-46
• 文献综述 ATF3与炎症调控46-54
• 参考文献50-54
• 攻读学位期间发表的论文54-55
• 致谢55

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本文编号：991828