GⅡ-4型诺如病毒P粒子制备及HBGAs相关性研究

发布时间：2017-03-26 10:05

  本文关键词：GⅡ-4型诺如病毒P粒子制备及HBGAs相关性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的分析GII-4型诺如病毒广州株GZ20133135全基因组序列,了解其基因结构的特点以及基因组类型。应用分子生物学手段制备GII-4型No V P粒子,通过酶免疫分析试验(Enzyme immune assays,EIA)为基础的唾液结合实验和寡糖结合实验分析我国主要基因型95/96 US株、2006b株、Sydney株等3种毒株与组织血型抗原(Histo-blood group antigens,HBGAs)的相关性,以获得我国No V流行株与HBGAs的结合模式,从而确定诺如病毒流行株感染的宿主范围,为进一步研究No V与宿主受体之间的关系及No V疫苗和防治药物的研发提供实验基础和理论依据。方法1诺如病毒广州株GZ20133135全基因组序列测定及分析:依据Sydney2012全基因组参考株进行引物的设计,用RT-PCR分段的方式对诺如病毒全基因组进行扩增,经过分子克隆的手段、测序以后再进行系统的进化分析。2制备GII-4型诺如病毒P粒子:选择Sydney2012代表株3135,通过基因工程方法构建表达质粒p GEX4T1-P,将鉴定正确的p GEX4T1-P质粒转化BL21(DE3)感受态菌,挑选单克隆菌落小量表达,SDS-PAGE鉴定是否有融合蛋白产生。随后将保存菌种活化进行目的蛋白的大量表达,利用琼脂糖-4B柱对P蛋白进行纯化并通过凝血酶除去GST融合蛋白标签以形成二十四聚体的P粒子。3分析不同型别诺如病毒株与组织血型抗原的亲和性:利用ELISA唾液结合实验分析3个型别的诺如病毒流行株与唾液中的HBGAs受体相结合的情况。利用HBGAs表型已明确的54份唾液样本包被96孔酶标板,加纯化的No V P粒子与之反应,以相应的鼠抗GII-4 No V P血清为一抗,二抗为HRP标记的山羊抗鼠Ig G,加入TMB显色液,在酶标仪上的450nm波长处显示的OD值。通过3个毒株的P蛋白对lea、leb、lex、ley、A、B、H1和H2型寡糖进行EIA为基础的寡糖结合实验。综合唾液结合及寡糖结合的实验分析三个诺如病毒流行株与HBGAs受体的结合方式。结果1诺如病毒广州株GZ20133135全基因组序列测定及分析:GII-4型诺如病毒广州株GZ20133135病毒基因组全长7566bp,其病毒基因组分为三个开放阅读框(ORFs),ORF1、ORF2及ORF3长度分别为5100bp、1623bp和807bp,ORF1与ORF2之间有19个核苷酸重叠。广州株GZ20133135全基因组的序列与参考株GII-4型Sydney2012变异株序列的同源性最高,全长同源性为99.07%。通过系统的进化分析表明,广州株GZ20133135株属于GII-4 Sydney2012的变异株。通过对衣壳区541个氨基酸比对,Sydney2012变异株位点变化情况为:aa294 V或A或P→T,aa296 S或T→S,aa297H或Q→R,aa298D或N或T→N,aa368 T或N或S或A→E,aa372 N或S→D,aa393 N或D或S,aa394 T或G或S→T,aa395 T或A→T,aa407 N或D→S,aa412 T或D→N,aa413 G或I→T。2制备GII-4型诺如病毒P粒子:PCR扩增得到3135 P区序列,大小都为991bp。成功构建表达质粒4T1-3135 P,测序结果证实连接的表达片段长为972个核苷酸,编码324个氨基酸。SDS-PAGE电泳分析证实成功表达了分子量约62k Da的可溶性的GST-P融合蛋白和分子量为36k Da的目的蛋白P蛋白。3分析不同型别诺如病毒株与组织血型抗原的亲和性:通过P蛋白的唾液结合实验分析得到3135-P、9711-P和55019-P诺如病毒与唾液HBGAs的结合模式。9711及55019株的P粒子与A、B、AB、O+型唾液能够结合,而与O-型唾液则均不结合。3135株P粒子与A、B、AB、O+、O-型唾液均结合。通过寡糖结合实验发现3135与lea、leb、A、B、H2型结合;55019与leb、ley、A、B、H2型寡糖结合;9711与leb、ley、A、B型寡糖结合。结论1广州株GZ20133135株属于GII-4 Sydney2012变异株;2成功构建诺如病毒表达质粒4T1-3135 P,并获得目的蛋白P粒子;3 HBGAs与3135、9711和55019 GII-4型No V的结合呈现毒株特异性。由唾液及寡糖结合实验综合分析发现9711株及55019株的P粒子与A、B、AB、O+血型唾液能够结合,与O-血型唾液则均不发生结合。3135株P粒子与A、B、AB、O+、O-血型唾液均结合。
【关键词】：诺如病毒 GII-4型 组织血型抗原 结合模式
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-14
• 第1章 诺如病毒广州株GZ20133135全基因组序列测定及分析14-26
• 1.1 材料与方法14-20
• 1.1.1 标本14
• 1.1.2 主要试剂14
• 1.1.3 主要溶液配制14-15
• 1.1.4 主要仪器15-16
• 1.1.5 标本处理16
• 1.1.6 病毒核酸的提取16
• 1.1.7 病毒RNA逆转录16-17
• 1.1.8 病毒基因组扩增17-18
• 1.1.9 结果鉴定18-20
• 1.2 结果20-23
• 1.2.1 诺如病毒基因组结构特征20
• 1.2.2 诺如病毒基因组全序列比较20-21
• 1.2.3 1991年至今诺如病毒GII-4 型变异株ORF2区氨基酸位点变化情况分析101.3 讨论21-23
• 1.4 结论23
• 参考文献23-26
• 第2章 GII-4 型诺如病毒P粒子制备及HBGAs相关性研究26-46
• 2.1 材料和方法26-37
• 2.1.1 材料26-28
• 2.1.2 扩增广州新爆发Sydney代表株 3135 P区基因序列28-29
• 2.1.3 pGEM-T Easy-P的TA克隆29-31
• 2.1.4 构建表达质粒pGEX4T1-P31-32
• 2.1.5 表达目的蛋白32-33
• 2.1.6 GST融合蛋白的纯化33-34
• 2.1.7 唾液表型测定34-35
• 2.1.8 EIA检测P蛋白与HBGAs受体的结合35-36
• 2.1.9 寡糖结合分析实验36-37
• 2.2 结果37-42
• 2.2.1 扩增GII-4 型NVs P区基因序列37
• 2.2.2 构建PGEM-Teasy-P重组质粒37-38
• 2.2.3 构建PGEM-4T1-P表达质粒38
• 2.2.4 P蛋白的小量表达38-39
• 2.2.5 P蛋白的大量表达及纯化39
• 2.2.6 唾液表型测定39-40
• 2.2.7 EIA检测P蛋白与HBGAs受体的结合40-42
• 2.2.8 寡糖结合实验42
• 2.3 讨论42-45
• 2.4 结论45
• 参考文献45-46
• 第3章 综述46-59
• 3.1 诺如病毒基因组特征46
• 3.2 诺如病毒蛋白质46-47
• 3.2.1 非结构蛋白46-47
• 3.2.2 结构蛋白47
• 3.3 诺如病毒与宿主的相互作用47-49
• 3.4 诺如病毒流行病学特征49-50
• 3.5 诺如病毒感染的临床表现50
• 3.6 诺如病毒检测方法50-52
• 3.6.1 电镜法50-51
• 3.6.2 免疫学方法51
• 3.6.3 分子生物学方法51-52
• 3.7 治疗、预防及疫苗的研究52-53
• 3.8 小结53-54
• 参考文献54-59
• 结论59-60
• 致谢60-61
• 导师简介61-62
• 作者简介62-63
• 学位论文数据集63

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 谭冬梅;刘巍;;诺如病毒GⅡ.4基因型的流行变迁和进化机制[J];应用预防医学;2014年01期

2 杨翼龙;谭小华;廖伟东;;1起社区水源性诺如病毒感染性腹泻暴发疫情的流行病学调查[J];华南预防医学;2014年02期

3 李琛;廖焕金;兰巧芬;盛慧英;叶玲;李亚宁;王刚;潘庆军;;创新型诺如病毒GⅠ/GⅡ抗原荧光纳米颗粒快速联检试纸条检测效能测评[J];标记免疫分析与临床;2015年06期

4 陈敏玫;周开姣;居昱;谭毅;;2012年广西首次检出诺如病毒GⅡ.4 Sydney变异株[J];疾病监测;2014年01期

5 林迪;孙长贵;;诺如病毒感染及其实验室检查[J];实验与检验医学;2015年01期

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 戴迎春;基于P颗粒的诺如病毒GII.4型流行株进化机制及免疫保护研究[D];南方医科大学;2013年

2 马丽萍;贝类中诺如病毒的风险评估及与组织血型抗原相关性[D];上海海洋大学;2013年

3 薛亮;诺如病毒GⅡ型流行株基因组特征分析及进化机制研究[D];华南理工大学;2013年

4 钟雪飞;重庆地区儿童病毒性腹泻病原分子流行病学研究[D];重庆医科大学;2014年

5 赛林涛;济南成人诺如病毒感染及儿童轮状与诺如病毒感染特征比较的研究[D];山东大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 张翠红;GⅡ-4型诺如病毒P粒子的表达及其与组织血型抗原结合的初步研究[D];南华大学;2013年

2 赵德坚;深圳地区C组轮状病毒和G1型小双节RNA病毒的分子进化分析[D];南方医科大学;2014年

3 田胜男;小鼠诺如病毒检测方法的研究[D];北京协和医学院;2014年

4 赵进;重庆地区门诊儿童急性腹泻相关病毒的流行特征与基因特征研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2014年

5 周钰滢;五味子酒剂的研制[D];哈尔滨商业大学;2015年

  本文关键词：GⅡ-4型诺如病毒P粒子制备及HBGAs相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：268631