结核分枝杆菌Rv3407重组蛋白、DNA疫苗的制备及其免疫原性的研究

发布时间：2017-03-30 14:21

  本文关键词：结核分枝杆菌Rv3407重组蛋白、DNA疫苗的制备及其免疫原性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：全世界大概有1/3的人感染结核分枝杆菌(M.tb),其中5%~10%的感染者会发展为结核病患者,因此,对结核病潜伏感染进行有效防治至关重要。卡介苗是目前预防结核病唯一的一个疫苗,但并不能有效地预防潜伏感染发展为结核病,其免疫效果并不十分确定,因此针对潜伏感染的疫苗的开发对于结核病的控制具有重要的意义。M.tb Rv3407是与M.tb复苏和再激活相关的蛋白,是潜伏感染M.tb活动的标志。制备rv3407 DNA疫苗可能对潜伏的M.tb有免疫清除作用,抑制M.tb的复燃,对潜伏感染人群具有免疫保护作用。因此,有可能成为一种新型的针对潜伏感染的候选疫苗,为结核病的预防和控制奠定实验基础。本研究应用生物信息学软件分析Rv3407蛋白的抗原表位,了解其抗原性;应用分子克隆技术制备了Rv3407重组蛋白;构建了rv3407DNA疫苗,并评价了该疫苗在小鼠体内的免疫原性。一、结核分枝杆菌Rv3407蛋白抗原表位的预测利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv3407氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、可及性、柔韧性、电荷分布等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位。利用SYFPEITHI和RANKPEP在线远程预测其Th细胞表位。利用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和NetCTL在线远程预测其CTL表位。结果显示Rv3407蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,潜在的B细胞抗原表位较多,可能位于11~26、28~43、50~61、66~74、76~99位氨基酸残基或其附近,这些区域基本上含有β转角结构,亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高。该蛋白潜在的T细胞抗原表位也较多,可能位于2~12、22~26、34~37、40~44、56~60、75~79、86~93位氨基酸残基或其附近。综合syfpeithi和rankpep预测结果,共筛选出hla-drb1*0101、hla-drb1*0301、hla-drb1*0401、hla-drb1*0701、hla-drb1*0801、hla-drb1*1101、hla-drb1*1501表型评分在23分以上或有意义的th候选表位22个。综合分析blast比对结果及syfpeithi、bimas和netctl的预测结果,结果显示rv3407蛋白抗原在hla-a*0201、hla-a*03和hla-b7评分在18分以上或有意义的限制性ctl候选表位共有20个。二、结核分枝杆菌rv3407的克隆、表达、纯化通过pcr扩增rv3407基因,以质粒pet30a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌bl21(de3),以iptg诱导基因工程菌表达目的蛋白,通过sds-page电泳鉴定pet30a-rv3407在大肠杆菌中的表达,确定pet30a-rv3407蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式。采用proteinisoni-ntaresin纯化重组蛋白。结果显示rv3407基因扩增成功;重组质粒pet30a-rv3407构建成功,测序结果与报道序列相同,在大肠杆菌中以可溶性形式表达。蛋白分子量约11kda,纯化得到目的蛋白。三、结核分枝杆菌rv3407dna疫苗的制备以h37rv基因组为模板,将rv3407基因进行pcr,扩增产物回收后连接入克隆载体pgem-t中,转化大肠杆菌dh5α,pcr鉴定及测序鉴定正确后提取质粒pgem-t-rv3407,经nheⅠ和ecorⅠ双酶切鉴定正确后,大量双酶切凝胶回收rv3407基因片段,与同样经nheⅠ和ecorⅠ双酶切的真核表达载体pvax1通过t4dna连接酶相连接,进而转化大肠杆菌dh5α,筛选阳性克隆进行pcr鉴定及测序鉴定正确,证明真核表达质粒pvax1-rv3407构建成功。应用qiagen质粒大提试剂盒大量提取质粒dna。将质粒dna转染hek293细胞,提取rna后用toyobo反转录试剂盒反转录,进行pcr,扩增出约318bp的rv3407基因片段,证明在转录水平有rv3407的表达。四、结核分枝杆菌rv3407dna疫苗免疫原性的研究将50只雌性balb/c小鼠随机分为下列5组:灭菌注射用水组、载体质粒pVAX1 DNA组、微卡菌苗组、Ag85A DNA疫苗组、rv3407DNA疫苗组,每组10只,通过双侧胫前肌注射的方法免疫小鼠,每2周1次,共3次,第3次免疫后3周杀死小鼠。应用流式细胞术分别检测小鼠全血内Th1、Th2细胞百分比及Th1/Th2比值,Tc1、Tc2细胞百分比及Tc1/Tc2比值;通过ELISA方法检测血清中抗Rv3407抗体IgG;通过ELISA方法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平。流式结果显示rv3407 DNA疫苗组Th1细胞百分比显著高于灭菌注射用水组、载体组和微卡组(p0.01),与Ag85A DNA疫苗组无显著性差异;Th2细胞百分比较灭菌注射用水组、微卡组和Ag85A DNA疫苗组低,但无显著性差异;Th1/Th2细胞比值显著高于灭菌注射用水组、载体组和微卡组(p0.01),与Ag85A DNA疫苗组无显著性差异;Tc1细胞百分比高于灭菌注射用水组、载体组和微卡组,但无显著性差异;Tc2细胞百分比各组间无显著性差异;Tc1/Tc2细胞比值高于灭菌注射用水组、载体组和微卡组,但无显著性差异。ELISA结果显示rv3407 DNA疫苗组和Ag85A DNA疫苗组小鼠特异性抗体Ig G水平显著高于灭菌注射用水组、载体质粒组和微卡菌苗组(p0.01)。脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ检测结果显示3/10 rv3407 DNA疫苗组和1/10载体组小鼠产生高水平的IFN-γ,而灭菌注射用水组、和微卡组没有小鼠产生IFN-γ。综上所述,结核分枝杆菌Rv3407蛋白是个T细胞、B细胞抗原表位都较丰富的抗原;成功地制备了Rv3407重组蛋白和rv3407 DNA疫苗;rv3407 DNA疫苗可诱导体液免疫反应和Th1型细胞免疫反应,具有较好的免疫原性,将进一步研究其抗结核作用。
【关键词】：结核分枝杆菌 Rv3407 抗原表位 重组蛋白 DNA疫苗 免疫原性
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 英文缩写12-14
• 前言14-15
• 材料和方法15-41
• 结果41-47
• 附图47-58
• 附表58-60
• 讨论60-64
• 结论64-65
• 参考文献65-68
• 综述68-74
• 参考文献71-74
• 致谢74-75
• 个人简历75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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  本文关键词：结核分枝杆菌Rv3407重组蛋白、DNA疫苗的制备及其免疫原性的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：277351