Rad1抗体的制备与ccFv抗体展示系统

发布时间：2017-04-03 13:05

  本文关键词：Rad1抗体的制备与ccFv抗体展示系统，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的1使用杂交瘤技术制备小鼠DNA损伤响应蛋白Rad1(m Rad1)抗体;利用该抗体研究Rad1的定位及DNA损伤压力下Rad1的行为。2用卷曲螺旋异源二聚体(cc Fv)形式将抗体可变区展示在细菌内膜表面,构建大容量抗体突变库,利用流式精确分选对已获得的抗体进行亲和力成熟,为抗体的人工进化提供技术平台。方法1 PCR扩增小鼠Rad1并构建到原核表达质粒p GEX-6p-1上,利用GST层析柱纯化m Rad1蛋白,并用其免疫BABL/c小鼠,使用杂交瘤技术制备单克隆抗体;酶联免疫吸附、蛋白质印迹、免疫共沉淀和免疫荧光方法检测抗体应用性,生物大分子相互作用Surface Plasmon Resonace(SPR)测定抗体亲和力;用自制抗体通过蛋白质免疫印迹和免疫荧光实验检测Rad1在DNA合成抑制剂hydroxyurea(HU)作用下的表达情况。2双链抗体表达体系质粒的构建,易错PCR突变抗体库的构建,在细菌内膜上表达并展示抗体,流式细胞术分析分选,PCR回收优势抗体基因,抗体突变株的测序、筛选及表达,SPR测定抗体亲和力。结果1通过优化的杂交瘤技术成功获得了高质量的小鼠Rad1单克隆抗体F10,多种生化手段显示该抗体远优于商业来源抗体;利用该单抗发现:Rad1的表达受另一个DNA损伤响应蛋白Rad9的调控。2成功的构建了抗TNFα的抗体大容量cc Fv形式的细菌展示抗体库,利用该系统提高了抗体的亲和力,成功的将Rad1抗体基因展示于细菌内膜表面。结论1提高抗原纯度和增加免疫动物时间能够提高制备的单克隆抗体的特异性和亲和力。2制备的Rad1抗体F10可用于酶联免疫吸附、蛋白质印迹、免疫共沉淀和免疫荧光,亲和力特异性高。3 Rad1的表达受Rad9调控;研究结果指出,过去建立的DNA损伤修复模型需要修改。4细菌内膜双链抗体展示系统能够成功进化抗体的亲和力,流式精准分选具有重要意义,该新型抗体展示平台丰富了抗体展示平台。
【关键词】：Rad9-Rad1-Hus1(9-1-1)复合体 Rad1 卷曲螺旋异源二聚体可变区(ccFv) 抗体表面展示 亲和力成熟
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-14
• 第1章 高质量Rad1抗体的制备及Rad1的细胞定位14-33
• 1.1 材料与方法14-22
• 1.1.1 主要实验材料和试剂14-17
• 1.1.2 方法17-22
• 1.2 结果22-28
• 1.2.1 高纯度mRad1抗原蛋白的获得22
• 1.2.2 Rad1单克隆抗体F10能够识别人、鼠Rad1蛋白22-23
• 1.2.3 F10亲和力的检测23-24
• 1.2.4 F10与市售Rad1抗体的比较24
• 1.2.5 Rad1对DNA抑制剂HU的应答24-25
• 1.2.6 内源Rad1的细胞定位25-27
• 1.2.7 Rad1单克隆抗体的序列、亚型测定及生物信息学分析27-28
• 1.2.8 Rad1单克隆抗体的ccFv展示28
• 1.3 讨论28-32
• 1.3.1 优质Rad1抗体的重要性28-29
• 1.3.2 单克隆抗体制备过程的优化29
• 1.3.3 Rad1抗体F10的优越性29
• 1.3.4 Rad1受Rad9的表达调控29-30
• 1.3.5 Rad1主要存在于MES细胞的细胞质中30
• 1.3.6 在HU处理下Rad1并没有表现出迁移进入细胞核的现象30
• 1.3.7 对不同批次抗体的生物信息学分析30-31
• 1.3.8 Rad1抗体的ccFv展示31
• 1.3.9 展望31-32
• 1.4 本章小结32-33
• 第2章 ccFv细菌内膜抗体展示平台的建立及应用33-48
• 2.1 材料与方法33-40
• 2.1.1 材料33-34
• 2.1.2 方法34-40
• 2.2 结果40-46
• 2.2.1 ccFv抗体可成功展示在大肠杆菌内膜表面40-41
• 2.2.2 ccFv抗体展示库优化抗体的可行性分析41-43
• 2.2.3 精确分选进化抗体亲和力及优化的抗体序列分析43-44
• 2.2.4 精确分选的灵敏性44-46
• 2.3 讨论46-48
• 2.3.1 ccFv抗体展示平台的优缺点46-47
• 2.3.2 精确分选的重要意义47
• 2.3.3 展望47-48
• 2.4 本章小结48
• 参考文献48-55
• 第3章 综述 科学研究的推动力——抗体与抗体进化55-79
• 3.1 9-1-1复合体与Rad1的研究进展55-58
• 3.1.1 9-1-1蛋白简介55-57
• 3.1.2 9-1-1蛋白复合体和肿瘤的关系57
• 3.1.3 Rad1的研究进展及其抗体的重要性57-58
• 3.2 单克隆抗体的发展58-62
• 3.2.1 单克隆抗体的发现及其结构功能58-59
• 3.2.2 基因工程抗体59-61
• 3.2.3 抗体与医学领域的密切关系61-62
• 3.3 ccFv细菌内膜抗体展示平台——新的抗体展示系统62-69
• 3.3.1 多种多样的抗体展示技术63-66
• 3.3.2 细菌展示技术66-69
• 3.4 结论和展望69-70
• 参考文献70-79
• 结论79-80
• 致谢80-81
• 导师简介81-82
• 作者简介82-83
• 学位论文数据集83

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