迟缓爱德华氏菌蓝藻口服疫苗的构建和免疫评价

发布时间：2017-04-09 02:02

  本文关键词：迟缓爱德华氏菌蓝藻口服疫苗的构建和免疫评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种危害性极大的致病菌,对我国鱼类养殖业造成巨大的经济损失,国外有该菌的注射疫苗,但接种极不方便,市场急需该菌的口服疫苗。本课题旨在开发用蓝藻作为宿主的与注射疫苗相比能大大节省人力财力的口服疫苗,并对该口服疫苗进行体内实验的评价。方法：本课题首先提取迟缓爱德华氏菌基因组DNA,用PCR技术分别将迟缓爱德华氏菌的两个免疫原性较好的蛋白基因Etal和GAPDH扩增,并通过重叠PCR将其融合,构建中间载体后再与可在大肠杆菌和蓝藻中穿梭表达的载体pRL489连接,之后将含有目的基因和该表达载体的大肠杆菌与含有接合质粒和辅助质粒的大肠杆菌混合,以三亲接合转移转化鱼腥藻PCC7120 (Anabaena sp. PCC7120),用新霉素抗性筛选出转基因藻,利用PCR结果测序,：RT-PCR验证该转基因藻,并用Western-blot方法检测融合基因的表达；本课题同时设计引物扩增融合后的基因,并将其先与中间载体连接验证正确后再与pET-30a表达载体连接,在BL21(DE3)菌中大量表达融合蛋白并用SDS-PAGE和Western-blot方法检测融合蛋白的表达。通过镍柱亲和层析和葡聚糖凝胶Sephadex G-100将其纯化。由于其携带有组氨酸标签,可被组氨酸抗体检测到,因此可以将其用做蛋白标准品。通过Western-blot实验后条带灰度值的比较测定蓝藻中融合蛋白的表达量。本课题最后通过反应器大规模培养转基因藻,离心收集藻细胞冻干。将年幼斑马鱼随机分成7组,每组25尾。设计实验分别喂食野生鱼腥藻7120,含pRL489空载体鱼腥藻7120,含融合基因转基因鱼腥藻7120。其中喂食含融合基因转基因藻又细分为高中低三个剂量组。再用致病性迟缓爱德华氏菌EIB202攻毒或用PBS假攻毒后记录鱼的存活情况,绘制各组鱼的死亡曲线以此评价疫苗免疫效果。结果：本课题成功构建在鱼腥藻PCC7120中表达的载体pRL-489-etal-L-gapdh,并将其转化大肠杆菌和鱼腥藻PCC7120,并在大肠杆菌和蓝藻中均检测到融合蛋白的表达,然而表达的产物分子量与预期大小不一致,比预期大小偏小,然而在这两个体系中表达的融合蛋白其分子量是一致的；同时本课题构建pET-30a表达载体上融合基因检测到了大量表达,分子量大小与预期一致；又进一步将其纯化,并据此计算出融合蛋白在转基因藻中的表达量为2.46%左右。本课题最后评价转基因藻的免疫保护作用,发现所构建的转基因鱼腥藻并不能对受试斑马鱼产生保护作用。结论及意义：本课题成功构建了在蓝藻和大肠杆菌中表达的两个表达载体,并成功检测到目的基因在大肠杆菌中和蓝藻中获得表达。本课题为口服形式的鱼用迟缓爱德华氏菌疫苗的开发提供了很好的思路。首先,课题选用蓝藻作为口服疫苗的载体,既能利用蓝藻的细胞壁保护口服疫苗在到达鱼消化道前不被破坏,又可以将疫苗作为鱼的天然饲料饲喂需要免疫的鱼苗；其次,课题中采用将多个免疫原性基因融合并表达融合蛋白的方式,可以作为疫苗开发的一个思路。另外本课题构建的pET系统表达融合基因效果非常好,可以考虑将其表达的融合蛋白纯化并开发成疫苗。
【关键词】：迟缓爱德华氏菌 口服免疫 融合蛋白 鱼腥藻PCC7120 鱼用疫苗
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 符号说明11-12
• 第1章 文献综述12-23
• 1.1 鱼用疫苗类型12
• 1.2 鱼用疫苗接种方式12-13
• 1.3 鱼病害迟缓爱德华氏菌疫苗的研究进展13-17
• 1.3.1 灭活疫苗14
• 1.3.2 弱毒疫苗14-15
• 1.3.3 DNA疫苗15-16
• 1.3.4 亚单位疫苗16
• 1.3.5 空壳疫苗16-17
• 1.3.6 外膜小泡疫苗17
• 1.4 蓝藻作为口服疫苗载体的可行性17-18
• 参考文献18-23
• 前言23-25
• 第2章 材料与方法25-69
• 2.1 实验材料25-29
• 2.1.1 菌种,藻种25
• 2.1.2 质粒载体25
• 2.1.3 工具酶25-26
• 2.1.4 核酸蛋白分子Marker及Loading buffer26-27
• 2.1.5 试剂27
• 2.1.6 鱼27-28
• 2.1.7 仪器28-29
• 2.1.8 试剂盒29
• 2.1.9 抗体29
• 2.2 实验方法29-69
• 2.2.1 常用试剂溶液的配制29-33
• 2.2.2 常用实验方法33-39
• 2.2.3 迟缓爱德华氏菌HtD基因组DNA的提取39
• 2.2.4 PCR扩增迟缓爱德华氏菌免疫原性蛋白基因etal及gapdh39-41
• 2.2.5 重叠PCR扩增融合基因(etal-L-gapdh)41-43
• 2.2.6 融合基因(etal-L-gapdh)与克隆载体的连接及验证43-44
• 2.2.7 融合基因(etal-L-gapdh)与表达载体的连接及验证44-48
• 2.2.8 表达载体pRL489-etal-L-gapdh转化鱼腥藻712048-50
• 2.2.9 PCR验证转基因鱼腥藻712050-52
• 2.2.10 转基因蓝藻稳定性考察52-54
• 2.2.11 转基因藻中融合基因转录表达分析54-57
• 2.2.12 大肠杆菌中融合基因蛋白表达分析57-58
• 2.2.13 转基因藻中融合基因蛋白表达分析58-59
• 2.2.14 用于pET体系的表达载体构建59-62
• 2.2.15 融合基因在pET-30a体系中的表达验证62-64
• 2.2.16 融合蛋白的分离纯化64-65
• 2.2.17 转基因藻中融合蛋白表达量的确定65-66
• 2.2.18 转基因藻免疫斑马鱼实验66-69
• 第3章 结果与讨论69-98
• 3.1 迟缓爱德华氏菌HtD基因组DNA69
• 3.2 免疫原性蛋白基因etal及gapdh的PCR扩增69-70
• 3.3 重叠PCR扩增融合基因70-71
• 3.4 融合基因(etal-L-gapdh)与克隆载体的连接及验证71-75
• 3.5 融合基因与表达载体的连接及验证75-78
• 3.6 表达载体转化鱼腥藻712078-79
• 3.7 抗生素筛选转基因鱼腥藻712079
• 3.8 PCR验证转基因鱼腥藻712079-81
• 3.9 转基因蓝藻稳定性考察81-82
• 3.10 转基因藻中融合基因转录表达分析82-84
• 3.11 大肠杆菌中融合基因蛋白表达分析84-85
• 3.12 转基因藻中融合基因蛋白表达分析85-88
• 3.13 用于pET体系的表达载体构建88-90
• 3.14 融合基因在pET-30a体系中的表达验证90-91
• 3.15 融合蛋白的分离纯化91-92
• 3.16 Western-blot验证不同宿主中融合蛋白表达92-93
• 3.17 转基因藻中融合蛋白表达量的确定93-95
• 3.18 转基因藻免疫斑马鱼实验95-98
• 第4章 结语98-101
• 参考文献101-104
• 致谢104-105
• 在学期间主要研究成果105

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