维生素D减少RUPP模型大鼠蛋白尿的作用

发布时间：2017-04-15 02:15

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【摘要】：目的:子痫前期是人类妊娠期特有的疾病,其发病率约占全部妊娠的2-8%。子痫前期的主要特征为水肿,高血压,和蛋白尿。严重时产生抽搐,昏迷等,是导致早产、胎儿宫内发育迟缓、新生儿窒息,甚至母婴死亡的主要原因之一。子痫前期所引起的蛋白尿与肾小球的滤过屏障功能受损有着密不可分的关系。因此,我们有必要弄清子痫前期蛋白尿的发病机制,找到干预措施。大量的临床和实验研究证明,活性维生素D能通过抑制肾脏局部组织肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性,抑制肾素基因转录,减少糖尿病肾病患者蛋白尿。动物实验也证明,活性维生素D类似物可以减轻糖尿病肾病大鼠系膜弥漫性增宽等病理改变,减少足细胞相关蛋白的缺失,减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿。考虑子痫前期孕妇血清中25(OH)D_3的水平下降,而维生素D缺乏的孕妇患子痫前期的风险增加的事实,我们假设活性维生素D能缓解子痫前期的蛋白尿现象。为了证实此假设,本实验用公认的子宫胎盘灌注压下降(RUPP)模型大鼠模拟子痫前期表型,观察活性维生素D对肾脏损伤及蛋白尿,以及足细胞相关分子的变化的影响,探讨维生素D在子痫前期中的作用,为其用于缓解子痫前期蛋白尿提供新的实验证据。方法:1实验动物以本实验室田晓瑜制备的三月龄SD孕大鼠的子宫胎盘灌注压下降模型(RUPP)为实验对象,将其分为单纯妊娠组(NP group)、RUPP手术组(RUPP group)、RUPP手术+1,25(OH)_2D组(RUPP+VD group)。2标本收集和指标测定孕18天时,收集24小时尿液,孕19天时,麻醉状态下,颈动脉取血4-5ml,取肾脏组织,分别用于尿蛋白,血清和组织中钙的测定,组化/免疫组化和电镜观察,以及目的基因表达的测定。3全自动生化分析仪(Beckman Coulter,AU5821,USA)测定尿蛋白,血钙和组织钙。4实时定量PCR检测肾脏VDR,CYP24A1,nephrin,CD2AP,integrinβ1,podocin和α-actinin-4的mRNA表达。使用美国OMEGA公司总RNA提取试剂盒提取大鼠肾脏组织总RNA,以18S rRNA做内参,实时定量PCR测定VDR,CYP24A1,nephrin,CD2AP,integrinβ1,podocin和α-actinin-4 mRNA的相对表达量。5 PAS法检测大鼠肾脏肾小球结构对大鼠肾脏组织石蜡切片进行PAS染色,检测肾小球结构变化情况。测量肾小球直径,计数肾小球平均细胞核数。6透射电镜观察肾脏超微结构透射电镜观察大鼠肾脏组织肾小球滤过屏障结构的变化。7免疫组织化学分析肾脏组织PCNA、nephrin的蛋白水平对大鼠肾脏组织石蜡切片进行免疫组织化学染色,分析PCNA、nephrin的蛋白水平。8 Western blot检测肾脏VDR、PCNA和CD2AP的蛋白表达提取大鼠肾脏组织总蛋白,以β-actin为内参,Western blot测定VDR、PCNA和CD2AP蛋白的相对表达量。9数据处理采用SPSS 17.0软件进行统计学处理分析,对所测定结果进行正态性及方差齐性检验,正态分布数据用x±SD表示,三组间比较用单因素方差(One-way ANOVA)分析,两两比较用SNK法。检验以P0.05为差异有显著性意义。结果:1补充1,25(OH)_2D可以增加RUPP大鼠的血钙含量虽然大鼠肾皮质中,三组钙含量(NP=44.1±18.27,RUPP=44.9±21.66,RUPP+VD=38.44±11.21,μmol/mg pr.×100)并没有显著变化,但是RUPP+VD组的血清钙水平(1.22±0.06 mmol/L),与NP组(1.08±0.06mmol/L,p0.01)和RUPP组(1.14±0.1 mmol/L,p0.05)相比,均有明显的升高。表明,1,25(OH)_2D可以增加血清中的钙含量,1,25(OH)_2D确实发挥了作用。2肾脏是1,25(OH)_2D的作用靶点2.1 RUPP鼠肾组织的维生素D受体(VDR)的mRNA(p0.001)和蛋白的表达比NP组明显下降,但两组蛋白表达差异无统计学意义。给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组的mRNA(p0.001)和蛋白(p0.05)水平显著升高。2.2 CYP24A1是VDR的下游基因。PCR结果显示,RUPP+VD组肾组织CYP24A1 mRNA的表达较NP组(p0.001)和RUPP组(p0.05)均明显升高。提示,1,25(OH)_2D确实是在肾脏中通过与VDR受体结合而来发挥作用。2.1和2.2的结果表明,肾脏是1,25(OH)_2D的作用靶点。3补充1,25(OH)_2D可以减少RUPP大鼠的蛋白尿RUPP组大鼠的尿蛋白(5.99±1.76 mg/24h)较NP组高(3.5±0.73mg/24h,p0.05);给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组的尿蛋白(3.71±1.38mg/24h)较RUPP组低(5.99±1.76 mg/24h,P0.01)。表明,补充1,25(OH)_2D可以缓解RUPP大鼠的蛋白尿。4补充1,25(OH)_2D可以改善RUPP大鼠肾小球的超微结构4.1光镜下PAS染色可见大鼠肾脏的肾小球,肾小囊以及肾小管等结构。NP组大鼠的肾脏组织结构正常,肾小球结构完整,未见到肾小球的肥大,毛细血管袢开放良好,无细胞增多,基质无明显改变。与NP组相比,RUPP组和RUPP+VD组中以上结构未见明显变化,肾小球直径和肾小球平均细胞核数均无明显变化,表明1,25(OH)_2D未能改善肾小球结构。4.2电镜下可见大鼠肾小球滤过膜的三层结构:血管内皮细胞(EC,endothelial cells)、基底膜(bm,basement membrane)和足细胞足突(箭头→,podocytic process)。与NP组相比,RUPP组肾小球的滤过膜结构有所改变:大部分足突融合,基底膜增厚,隆起呈丘状。而给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组的基底膜增厚和足细胞融合现象有所改善。说明,RUPP鼠的肾小球虽未出现明显的病理改变,但肾小球滤过膜超微结构有改变。因此1,25(OH)_2D降低RUPP鼠蛋白尿与其逆转滤过膜结构的改变有关。5补充1,25(OH)_2D可以降低RUPP大鼠中增殖相关蛋白PCNA的表达Western和免疫组化(棕黄色颗粒)的结果显示,作为增殖相关蛋白的PCNA在肾小球和肾小管中都有表达,阳性颗粒定位于细胞核中。与NP组相比,其表达水平在RUPP组中有升高趋势,但差异无统计学意义。给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组的PCNA的蛋白表达水平明显下降(P0.01)。提示,1,25(OH)_2D降低了增殖相关蛋白PCNA的表达。虽然上述4.2的结果未显示各组大鼠的肾小球有增殖的迹象,但考虑到分子变化早于结构的变化,我们认为1,25(OH)_2D很可能还抑制了RUPP组大鼠肾组织的增殖,降低了蛋白尿。6 1,25(OH)_2D通过上调nephrin和CD2AP的表达来改善子痫前期产生的蛋白尿6.1 Nephrin是足细胞裂孔隔膜上的分子,参与构成裂孔隔膜的拉链状结构,对维持裂孔膜的完整性起着重要作用。与NP组大鼠相比,RUPP组大鼠的肾脏中nephrin的mRNA表达水平和蛋白质的表达水平(棕黄染色浅)均明显减弱(P0.001)。给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组的nephrin的mRNA表达(P0.001)和蛋白质(棕黄染色加深,P0.05)表达水平均上调。6.2 CD2AP是使裂隙隔膜蛋白nephrin和podocin锚定于足细胞的肌动蛋白细胞骨架。PCR和western的结果显示,与NP组相比,RUPP组的CD2AP的mRNA(P0.01)和蛋白(P0.05)表达水平均显著降低。与RUPP组相比,给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组CD2AP的mRNA(P0.001)和蛋白(P0.05)表达水平均显著升高。6.1和6.2的结果表明,蛋白尿的发生与nephrin和CD2AP的表达减少有关,1,25(OH)_2D可以上调nephrin和CD2AP的表达来降低RUPP大鼠的蛋白尿。6.3 integrinβ1是足细胞和基膜之间的重要黏附分子。PCR的结果显示,与NP组相比,RUPP组大鼠肾脏integrinβ1 mRNA表达水平显著下降(P0.001)。给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组大鼠的integrinβ1的mRNA表达水平显著升高(P0.001),但是integrinβ1的蛋白水平没有变化(Western结果未列出)。说明,RUPP组大鼠蛋白尿的发生可能与integrinβ1的低转录水平有关,但是1,25(OH)_2D并不影响肾integrinβ1基因的表达。6.4 Podocin是足细胞裂孔隔膜上的重要蛋白。PCR的结果显示,与NP组相比,RUPP组大鼠肾脏podocin的mRNA表达显著下降(P0.001),但是给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组大鼠的podocin mRNA的表达没有明显的改变。并且各组蛋白水平也没有变化(结果未列出)。说明,RUPP组大鼠蛋白尿的发生可能与podocin的低转录水平有关,但是1,25(OH)_2D并未影响肾podocin基因的表达。6.5 α-actinin-4是主要位于足细胞足突上的骨架肌动蛋白。PCR结果显示,与NP组相比,RUPP组大鼠肾脏α-actinin-4的mRNA表达显著下降(P0.001),但是给予1,25(OH)_2D后,RUPP+VD组大鼠α-actinin-4mRNA表达并未明显升高。并且各组蛋白水平也没有变化(结果未列出)。说明RUPP组大鼠蛋白尿的发生可能与α-actinin-4的低转录水平有关,但是1,25(OH)_2D并不影响α-actinin-4基因的表达。结论:1 1,25(OH)_2D可以减少妊高症大鼠的蛋白尿。2此作用与1,25(OH)_2D对大鼠肾脏的下列作用有关:(1)1,25(OH)_2D逆转了子痫前期大鼠肾小球滤过膜结构的改变。(2)1,25(OH)_2D上调了足细胞nephrin和CD2AP的表达。
【关键词】：维生素D 子痫前期 蛋白尿 足细胞 nephrin podocin
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.244;R-332
【目录】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-15
• 英文缩写15-16
• 前言16-18
• 材料与方法18-30
• 结果30-33
• 附图33-46
• 附表46-47
• 讨论47-50
• 结论50-51
• 参考文献51-54
• 综述 蛋白尿发生的相关分子及维生素D的改善作用54-71
• 参考文献64-71
• 致谢71-72
• 个人简历72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 LI XueZhu;HE John Cijiang;;An update: the role of Nephrin inside and outside the kidney[J];Science China(Life Sciences);2015年07期

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本文编号：307384