人脐带间充质干细胞的免疫调节能力的标准化与量化研究

发布时间：2017-04-15 10:04

  本文关键词：人脐带间充质干细胞的免疫调节能力的标准化与量化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：脐带来源间充质干细胞(human Umbilical Cord Mensenchymal Stem Cell,hUC-MSCs)具有更强更稳定的增殖分化能力,来源方便充足,对供者无伤害,病原微生物感染率低,安全性高。hUC-MSCs具有较高的免疫调控能力,是临床治疗血液疾病安全性高的异体干细胞。目前,传统的MSCs培养体系中含有一定比例的动物血清(Serum Containing Medium)成分,对间充质干细胞的临床应用造成安全隐患。本研究对比无血清与有血清培养体系培养的hUC-MSCs增殖、衰老、细胞表面及全能标志物、多向分化潜能,重点关注了两个培养体系在免疫抑制方面的不同,探索培养hUC-MSCs的标准化方法,达到临床的应用标准。目的：验证不同个体脐带来源间充质干细胞在无血清培养体系中培养的安全性以及免疫调节作用,安全的应用于临床治疗。方法：(1)比较hUC-MSCs在有血清与无血清培养体系体外长期传代以及衰老情况,测定生长曲线；长期传代至终末期,采用Cellular Sencence Assay Kit检测衰老相关的p半乳糖苷酶的活性；(2)流式检测hUC-MSCs在有血清与无血清培养体系体外培养其细胞表面分子标志以及全能标志物的检测；(3)对比hUC-MSCs在有血清与无血清培养体系体外培养其多向分化能力情况；(4)通过健康成人外周血激活期和静止期的NK细胞分别与不同个体不同培养体系培养的hUC-MSCs共培养,流式检测IFN-y阳性的NK细胞的百分比,评价对固有免疫的调节作用；(5)通过BrdU酶联免疫吸附法对比两个培养体系培养的hUC-MSCs对 PBMC增值的抑制能力；(6)比较hUC-MSCs在有血清与无血清培养体系体外培养后免疫抑制能力,通过不同个体不同培养体系培养的hUC-MSCs和健康成人外周血单个核细胞共培养,利用免疫酶联试剂盒检测上清中IFN-y的分泌水平,检测上清中PGE2、IDO、IL-6的分泌,Real-time PCR检测免疫相关因子TNF-beta、 IL-10、IL-27、Galectin-1、Galectin-3、IDO1、COX2、HGF及IL-6等mRNA的表达水平。结果：(1)无血清培养的hUC-MSCs呈典型的长梭形贴壁细胞,与有血清培养的hUC-MSCs相比生长曲线较平缓,对数生长较晚,较早出现p半乳糖苷酶的活性；(2)无血清培养与有血清培养的hUC-MSCs均高表达CD29, CD44, CD73, CD90,CD105及CD106等间充质干细胞的表面标记,不表达CD34,CD45,CD11b, CD19,HLA-DR,但是无血清培养的hUC-MSCs全能标志物Nanog, SOX2, Oct4, SSEA-4的阳性率更高；(3)无血清培养体系培养的hUC-MSCs与有血清培养的hUC-MSCs均具有成脂成骨成软骨分化能力；(4)两种培养体系培养的hUC-MSCs分别与激活期静止期的NK细胞共培养16h后,流式检测分泌IFN-y的NK细胞百分比均明显减少,两者没有明显差异,均对静止期NK细胞的抑制能力更强；(5)无血清和有血清培养体系培养的hUC-MSCs均抑制外周血单个核细胞的增殖,均明显抑制单个核细胞的IFN-y分泌,两者PGE2、IDO、IL-6的分泌均没有差异,无血清培养体系分泌的HGF明显高于有血清培养体系；(6)mRNA水平上无血清培养的hUC-MSCs表达的免疫相关因子TGF-beta1、IL-6、HGF高于有血清培养的hUC-MSCs表达的,但Galectin-1表达水平低于有血清培养的hUC-MSCs表达的。结论：(1)与传统的有血清培养体系相比较,无血清培养体系体外增殖速度较慢、较早出现衰老；(2)无血清培养和有血清培养的hUC-MSCs在细胞表面以及多向分化等生物学特性相似,无血清培养的hUC-MSCs具有更原始的状态；(3)无血清培养和有血清培养的hUC-MSCs均具有较强的免疫调节能力,且没有差异性。背景：间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞,在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞等多种组织系统的细胞。此外,在造血、免疫、炎症反应、血管新生等人体重要功能中起调节作用,现在更多关注MSCs的低免疫原性和免疫调节能力。脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)分离自脐带,涉及伦理问题较少相对更原始。MSC免疫抑制能力的最好例子是同种异体的MSC能有效治疗重度移植物抗宿主病。体外研究表明,MSC能够抑制T细胞免疫反应。目前对MSC免疫调节机制还不完全清楚,但是越来越多研究表明其主要通过细胞间接触如PD1-PD-L1,及可溶性因子如前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase, IDO)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)、转化生长因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)等发挥免疫抑制功能。hUC-MSC治疗自身免疫系统疾病、移植物抗宿主病已经由实验研究阶段进入临床试验阶段,多项临床试验证实hUC-MSC有很好的应用前景,但不同个体脐带来源间充质干细胞免疫活性差别很大,目前缺乏统一的标准方法筛选出强免疫调节能力的理想细胞。目的：验证不同个体脐带间充质干细胞免疫抑制能力具有稳定的差异性,以人外周血单个核共培养体系作为检测细胞生物学效力的方法不稳定因素太多,所以我们需探寻定量检测脐带间充质干细胞免疫活性的方法,为临床治疗打下基础。方法：(1)不同个体hUC-MSC和健康成人外周血单个核细胞体外共培养,免疫酶联试剂盒检测上清IFN-y的分泌水平,反应人脐带间充质干细胞对活化后的外周血单个核细胞免疫抑制能力；(2)外源性炎症因子刺激不同个体hUC-MSC在 mRNA水平上免疫相关因子的表达；(3)外源性炎症因子刺激不同个体hUC-MSC,培养24小时后收集上清。酶联免疫吸附法检测间充质干细胞PGE2、IDO、 Galectin-1、Galectin-3、TGF-beta1、HGF的分泌,验证蛋白分泌与免疫抑制能力的相关性；(4)吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)特异性抑制剂1-M-Trp、前列腺素E2(PGE2)合成抑制剂NS-398预处理,分别阻断hUC-MSCs分泌PGE2、IDO,和健康成人外周血单个核细胞共培养,检测阻断蛋白分泌后对hUC-MSCs免疫抑制效应的影响。结果：(1)不同个体hUC-MSCs对IFN-y分泌的抑制能力有显著性差异性稳定存在,对IFN-y分泌的抑制率可反映个体hUC-MSC的免疫抑制能力；(2)炎症因子刺激后IDO1、COX2、TGF-betal、Galectin-1、HGF、IL-6、Galectin-3等免疫相关因子mRNA明显升高,IL-10、IL-27未见明显变化。(3)比较不同个体hUC-MSC刺激后的因子分泌量与其抑制IFN分泌的抑制率的相关性,得出结论PGE2具最高的相关性,IDO、IL-6次之。(4)阻断IDO未逆转hUC-MSC对于活化单个核细胞IFN-γ抑制作用,但阻断PGE2后,hUC-MSC对活化单个核细胞IFN-γ抑制作用显著降低,尽管未完全逆转,但说明了PGE2的关键性作用。结论：不同个体hUC-MSC的免疫抑制能力差异较大,我们1.5×10S/孔的hUC-MSCs接种于24孔板6小时贴壁后弃上清,在炎症因子IFN-γ(5μg/ml)+TNF-α (1μg/ml)的刺激下培养24小时,若PGE2分泌量409.89ng/ml,定为高免疫活性的hUC-MSC,临床治疗效果最优。
【关键词】：无血清培养 有血清培养 hUC-MSCs 细胞增殖 免疫调节 脐带间充质干细胞 PGE_2 IDO 免疫抑制 定量检测
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 第一部分：标准化的无血清培养体系对人脐带来源间充质干细胞免疫调节活性的影响4-35
• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 前言8-9
• 材料与方法9-21
• 结果21-30
• 讨论30-32
• 结论32-33
• 参考文献33-35
• 第二部分：定量评估不同个体人脐带间充质干细胞的免疫调节能力35-62
• 中文摘要35-37
• 英文摘要37-39
• 前言39-40
• 材料与方法40-51
• 结果51-58
• 讨论58-59
• 结论59-60
• 参考文献60-62
• 附录一 主要仪器材料及试剂62-65
• 附录二 主要溶液的配置65-66
• 附录三 常见英文缩写和代码66-67
• 附录四 在学期间发表文章67-68
• 致谢68-69

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