HtrA2/Omi差异化调控年轻细胞及衰老细胞的应激敏感性
发布时间：2021-04-10 19:49
目的探讨HtrA2/Omi对年轻细胞和衰老细胞应激下凋亡发生的作用。方法建立氧化应激诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）衰老模型;构建可诱导过表达野生型（WT）和酶活性失活突变型HtrA2（S306A）/Omi的慢病毒Tet-On系统,用HUVECs建立稳转株;利用不同浓度的H2O2处理上述细胞株;衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测细胞衰老,TUNEL检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹及qRT-PCR检测HtrA2蛋白及mRNA水平。结果利用100μmol/L H2O2处理细胞1h成功建立氧化应激诱导的衰老模型;衰老细胞中HtrA2/Omi的蛋白及mRNA水平相对于年轻细胞升高;年轻细胞受氧化应激后,过表达野生型HtrA2/Omi的细胞凋亡数量少于对照组和过表达突变型HtrA2/Omi组;而衰老细胞受氧化应激后,过表达野生型HtrA2/Omi的细胞发生凋亡的数量多于对照组和过表达突变型HtrA2/Omi组。结论年轻细胞中过表达HtrA2/Omi能够抑制凋亡,而在衰老细胞中过表达HtrA2/O...
【文章来源】：成都医学院学报. 2020,15(03)
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
构建细胞衰老模型及细胞内HtrA2/Omi的表达
构建过表达HtrA2/Omi的稳转株后，首先检测其有效性，结果显示50μmol/L的DOX即可明显诱导HtrA2/Omi过表达，5μmol/L DOX诱导效果不明显，而500μmol/L和5 000μmol/L DOX诱导的表达量远远多于本底表达。有研究[10]证明，大量过表达HtrA2/Omi会直接诱导细胞凋亡发生，因此后续实验采用浓度为50μmol/L的DOX诱导HtrA2/Omi适量过表达。该结果证明了过表达HtrA2/Omi的稳转株构建成功（图2）。2.3 HtrA2/Omi增强年轻细胞抗氧化应激能力
分别用浓度为100、200、300μmol/L的H2O2处理HUVEC 3种细胞株[对照Ctrl组/过表达HtrA2(WT）组/突变HtrA2(S306A）组]1h，以未用H2O2处理的这3种细胞株作为对照。在未用H2O2处理的对照组内，HUVEC的3种细胞株数量无明显差异；而在用不同浓度H2O2处理的3种凋亡模型中，加DOX诱导HtrA2(WT）组过表达HtrA2/Omi后细胞的凋亡数量明显少于Ctrl组和HtrA2(S306A）组。然后对H2O2浓度为100、200、300μmol/L 3个组别的细胞剩余数量进行统计分析，结果显示，随着H2O2浓度的增加，3种细胞的剩余数量逐渐减少，并且在这3个浓度组别内，过表达野生型HtrA2/Omi的细胞剩余数量远多于Ctrl组和HtrA2(S306A）组（P<0.001），同时Ctrl组和HtrA2(S306A）组之间差异无统计学意义（P>0.05）（图3）。取上面浓度为100μmol/L的H2O2组别的3种细胞株分为两个实验组，一组加DOX诱导HtrA2/Omi过表达，另外一组不加DOX,5%CO2培养箱内孵育24h后TUNEL检测细胞凋亡情况，结果显示诱导HtrA2/Omi过表达的HtrA2(WT）组（6.91±1.26）%细胞其凋亡率明显低于未加DOX实验组的3种细胞[Ctrl(28.30±1.59）%、WT(29.70±3.27）%和S306A(30.37±2.74）%]以及加DOX实验组的Ctrl组（25.16±1.87）%细胞和S306A(HtrA2）组（33.80±1.83）%细胞，并且未加DOX诱导HtrA2/Omi过表达的3种细胞之间无明显差异，说明DOX不会对细胞凋亡产生影响。以上结果证明当细胞受到的应激刺激在线粒体可修复范围内时，HtrA2/Omi能够通过提高细胞对氧化应激的抗性来维持细胞的内稳态，达到年轻细胞抗凋亡的效果（图4）。
本文编号：3130237
【文章来源】：成都医学院学报. 2020,15(03)
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
构建细胞衰老模型及细胞内HtrA2/Omi的表达
构建过表达HtrA2/Omi的稳转株后，首先检测其有效性，结果显示50μmol/L的DOX即可明显诱导HtrA2/Omi过表达，5μmol/L DOX诱导效果不明显，而500μmol/L和5 000μmol/L DOX诱导的表达量远远多于本底表达。有研究[10]证明，大量过表达HtrA2/Omi会直接诱导细胞凋亡发生，因此后续实验采用浓度为50μmol/L的DOX诱导HtrA2/Omi适量过表达。该结果证明了过表达HtrA2/Omi的稳转株构建成功（图2）。2.3 HtrA2/Omi增强年轻细胞抗氧化应激能力
分别用浓度为100、200、300μmol/L的H2O2处理HUVEC 3种细胞株[对照Ctrl组/过表达HtrA2(WT）组/突变HtrA2(S306A）组]1h，以未用H2O2处理的这3种细胞株作为对照。在未用H2O2处理的对照组内，HUVEC的3种细胞株数量无明显差异；而在用不同浓度H2O2处理的3种凋亡模型中，加DOX诱导HtrA2(WT）组过表达HtrA2/Omi后细胞的凋亡数量明显少于Ctrl组和HtrA2(S306A）组。然后对H2O2浓度为100、200、300μmol/L 3个组别的细胞剩余数量进行统计分析，结果显示，随着H2O2浓度的增加，3种细胞的剩余数量逐渐减少，并且在这3个浓度组别内，过表达野生型HtrA2/Omi的细胞剩余数量远多于Ctrl组和HtrA2(S306A）组（P<0.001），同时Ctrl组和HtrA2(S306A）组之间差异无统计学意义（P>0.05）（图3）。取上面浓度为100μmol/L的H2O2组别的3种细胞株分为两个实验组，一组加DOX诱导HtrA2/Omi过表达，另外一组不加DOX,5%CO2培养箱内孵育24h后TUNEL检测细胞凋亡情况，结果显示诱导HtrA2/Omi过表达的HtrA2(WT）组（6.91±1.26）%细胞其凋亡率明显低于未加DOX实验组的3种细胞[Ctrl(28.30±1.59）%、WT(29.70±3.27）%和S306A(30.37±2.74）%]以及加DOX实验组的Ctrl组（25.16±1.87）%细胞和S306A(HtrA2）组（33.80±1.83）%细胞，并且未加DOX诱导HtrA2/Omi过表达的3种细胞之间无明显差异，说明DOX不会对细胞凋亡产生影响。以上结果证明当细胞受到的应激刺激在线粒体可修复范围内时，HtrA2/Omi能够通过提高细胞对氧化应激的抗性来维持细胞的内稳态，达到年轻细胞抗凋亡的效果（图4）。
本文编号：3130237
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