慢病毒介导的miR-505在下丘脑过表达对小鼠性发育的影响

发布时间：2017-04-20 22:20

  本文关键词：慢病毒介导的miR-505在下丘脑过表达对小鼠性发育的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：miRNAs（MicroRNAs）是一类具有调控功能的、内源性的天然非编码小RNA，其大小约为20—25个核苷酸；随着研究技术手段的提高和研究内容的深入，越来越多的研究结果表明：miRNAs可以调控大多数蛋白质编码基因的表达，以及参与大量生物过程的调节。许多人类疾病的发生，往往伴随着各种miRNAs非正常水平的表达。目前，miRNAs被普遍认为是具有生物学意义的潜在生物靶标、疾病调节器，并可以成为疾病治疗药物的靶点。 我们的前期遗传学研究结果提示，位于小鼠X染色体：57647578-57647667处的miR-505，可能参与了小鼠性发育启动的调控，但对其生物学功能的研究才刚刚起步。迄今为止的研究表明，miR-505可以通过诱导凋亡抑制细胞的增殖，其唯一被验证的靶蛋白ASF/SF2参与了mTOR信号通路的调控。为了进一步验证miR-505与性发育的关系及解析其可能的机制，本课题使用慢病毒定点注射的方法构建在下丘脑中过表达miR-505的小鼠模型，并通过该模型研究miR-505过表达对雌鼠性发育各种表型的影响，探讨miR-505与性发育启动的关系。 方法：利用本室构建的过表达miR-505慢病毒载体，包装得到表达miR 505的慢病毒颗粒，将出生15天的C57/BL6J雌性小鼠在脑立体定位仪进行下丘脑定位，将（1μl）的慢病毒注射到下丘脑中，构建miR-505在下丘脑中过表达小鼠模型，注射后每隔5天取脑制作冰冻切片，采用原位杂交和实时荧光定量PCR的方法，进行miR-505检测和示踪，以确认模型的构建成功。利用该模型观察和记录小鼠的性发育表型：包括体重增长、阴门开启时间、子鼠出生数量、流产率等；处死小鼠后，收集血清，用酶联免疫吸附测定小鼠血清中LH（促黄体生成素）、GnRH（促性腺激素释放激素）浓度；制作卵巢切片，观察并统计卵巢中卵泡的组织学形态与各级卵泡的数量；制作脑冰冻切片，用原位杂交ISH（in situ hybridization）方法对不同表型的小鼠下丘脑中miR 505的表达部位及数量进行示踪； 结果：实验结果显示在注射部位的小鼠下丘脑区域，miR-505表达量较对照组有明显提高，表明用该方法成功构建了miR-505在下丘脑中过表达的小鼠模型；与对照小鼠相比，模型小鼠体重增长缓慢，并且每日平均体重轻2-3g；阴门开启时间36.67±0.7993天，较对照组推迟3天；从合笼后到子鼠出生时间25.83±1.144天，较对照组延长3天；且流产率提高12%，并有8%的不育；模型小鼠生育后，子代数量减少、死亡率提高；卵巢切片的结果显示，模型小鼠卵巢中黄体出现时间推迟、数量也少于对照组；模型小鼠血清中LH（促黄体生成激素）含量低于对照组，GnRH（促性腺激素释放激素）含量出现不规律波动；脑切片中原位杂交的结果显示miR-505过表达部位对表型有影响。 结论：利用慢病毒注射未成年小鼠下丘脑脑区的方法，成功构建了下丘脑中过表达miR-505的模型；使用锁核酸标记探针与酪酰胺信号放大系统的原位杂交方法检测miRNA表达规律较稳定，且重复率高；模型小鼠与对照小鼠在生长发育、性发育启动时间、血清中促性腺激素含量及生殖能力等一系列生殖发育表型中表现出明显的差异，说明miR-505参与调控了小鼠的性发育和生殖过程，为对其生物学功能的进一步研究提供了依据。
【关键词】：MicroRNA 性发育 过表达动物模型 锁核酸 酪酰胺信号放大系统
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R339.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 目录9-11
• 第一章 前言11-19
• 1.1 哺乳动物性发育研究进展11-14
• 1.1.1 性发育过程中的神经内分泌11-12
• 1.1.2 性发育过程中的相关基因12-13
• 1.1.3 小鼠性发育过程中的性状13-14
• 1.2 立题背景14-16
• 1.2.1 本实验室 QTL 定位进展14
• 1.2.2 miR  505 研究进展14-15
• 1.2.3 miRNA 过表达载体15
• 1.2.4 原位杂交15-16
• 1.3 实验研究内容16-18
• 1.4 实验研究意义18-19
• 第二章 材料与方法19-38
• 2.1 实验材料19-22
• 2.1.1 实验群体19
• 2.1.2 实验仪器及试剂19-22
• 2.2 实验方法22-36
• 2.2.1 小鼠饲养22-23
• 2.2.2 原位注射23-24
• 2.2.3 制作冰冻切片24-26
• 2.2.4 总 RNA 抽提及定量26-27
• 2.2.5 实时荧光定量 PCR27-30
• 2.2.6 卵巢 HE 染色观察30
• 2.2.7 生殖表型观察30-31
• 2.2.8 ELISA 检测激素含量31-34
• 2.2.9 原位杂交34-36
• 2.3 数据分析36-38
• 2.3.1 基于 RT-PCR 的基因相对表达量分析36-37
• 2.3.2 ELISA 数据处理37
• 2.3.3 性发育表型数据处理37-38
• 第三章 结果与分析38-55
• 3.1 动物模型构建的验证38-40
• 3.1.1 RT-PCR 检测 miR-505 含量变化38-39
• 3.1.2 原位杂交方法示踪 miR-50539-40
• 3.2 性发育表型的观测40-45
• 3.2.1 各组小鼠注射后体重增长的监测40-41
• 3.2.2 各组小鼠注射后阴门开启时间的监测41-42
• 3.2.3 各组小鼠合笼到子鼠出生时间的监测42-43
• 3.2.4 各组小鼠子鼠出生及死亡的监测43-44
• 3.2.5 各组小鼠怀孕情况的监测44-45
• 3.3 卵巢发育相关表型检测45-49
• 3.3.1 各级卵泡的组织学形态观察45-46
• 3.3.2 各组小鼠卵巢组织学形态观察46-49
• 3.4 各组小鼠模型中相关雌激素水平的检测49-52
• 3.4.1 各组小鼠促黄体生成激素含量测定49-50
• 3.4.2 各组小鼠促性腺激素释放激素含量测定50-52
• 3.5 不同注射位置对小鼠表型的影响52-55
• 3.5.1 子鼠减少小鼠的原位杂交52-53
• 3.5.2 不育小鼠的原位杂交53-55
• 第四章 讨论55-59
• 4.1 慢病毒载体的定点注射55-56
• 4.2 目的基因相对表达水平测定56
• 4.3 原位杂交技术56-59
• 第五章 结论与展望59-61
• 参考文献61-66
• 课题来源66-67
• 攻读硕士学位期间发表学术论文目录67-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 罗小平,王慕逖;性早熟诊断与治疗的现状和进展[J];临床儿科杂志;2002年09期

2 徐勇,杨鲁静;青春期性发育调控的研究进展[J];中国预防医学杂志;2004年01期

  本文关键词：慢病毒介导的miR-505在下丘脑过表达对小鼠性发育的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：319639