利用CRISPR/Cas9构建FAH基因缺陷模型猪

发布时间：2021-05-20 04:14

　　随着科学技术的不断发展,人类迫切的需要对各种疾病进行透彻的了解和研究,从而开发出能够有效治疗疾病的手段。但是,由于伦理道德的限制,科学研究并不能直接以活人作为实验研究的对象。而动物可以作为科学研究的直接对象,科学家可以直接在符合伦理审查的活体动物上做实验。与小鼠、大鼠等啮齿类动物相比,猪作为在器官构造,大小及生理结构上更加接近于人的物种之一,因其诸多的优势被广泛用于科学研究,作为动物模型,猪拥有的最大优势。自基因编辑技术现世以来,科学家已经能够通过基因编辑,如锌指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFN）技术、转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALEN）技术和成簇规律性间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palidromic repeats,CRISPR/Cas）技术等获得基因编辑的动物,从而拿到动物疾病模型,进行相关疾病的研究。目前科研人员已经通过基因编辑技术逐渐建立了以小鼠,大鼠,兔子,猪为对象的FAH疾病模型。经... 

【文章来源】：曲阜师范大学山东省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第1章 引言
    1.1 基因编辑技术的发展
        1.1.1 锌指核酸酶(ZFN)
        1.1.2 TALEN
        1.1.3 归巢核酸内切酶
        1.1.4 CRISPR/Cas9系统
    1.2 FAH~(-/-)模型动物的研究进展
        1.2.1 动物疾病模型的进展
        1.2.2 FAH肝损伤模型动物的研究进展
    1.3 本研究的目的及意义
第2章 材料与方法
    2.1 实验动物
    2.2 实验材料
    2.3 实验主要仪器
    2.4 实验相关液体配方
    2.5 实验方法
        2.5.1 猪胎儿成纤维细胞系的建立
        2.5.2 gRNA的设计
        2.5.3 gRNA-CRISPR/Cas9载体构建
        2.5.4 猪成纤维细胞的核电转及FAH缺陷单克隆细胞系的获取
        2.5.5 猪卵母细胞的采集及体外成熟培养
        2.5.6 体细胞克隆
        2.5.7 胚胎移植
        2.5.8 FAH基因敲除猪的基因型鉴定
        2.5.9 组织石蜡切片及HE染色
        2.5.10 Western Blot
        2.5.11 免疫组化染色
        2.5.12 Masson染色
第3章 结果
    3.1 猪原代胎儿成纤维细胞的制作培养
    3.2 FAH基因敲除细胞系的制作
    3.3 体细胞克隆与胚胎移植获得怀孕母猪
    3.4 FAH模型克隆猪出生
    3.5 NTBC撤除后FAH~(-/-)猪出现肝脏和肾脏的坏死
    3.6 NTBC撤除后FAH~(-/-)猪出现肝纤维化
    3.7 外周血的血常规
第4章 讨论
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
在读期间发表的论文及研究成果
致谢



本文编号：3197067