基于重组酶介导等温扩增技术的广州管圆线虫核酸检测方法的建立
发布时间：2021-07-24 14:57
目的建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的广州管圆线虫核酸检测方法。方法选择广州管圆线虫内转录间隔区1（ITS1）基因序列作为靶基因序列,设计、合成并筛选出特异性最强的引物和探针,构建用于广州管圆线虫核酸检测的基础及荧光RAA检测方法。分别以含检测靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒以及不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板进行焚光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以广州管圆线虫、曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果成功建立了用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,该方法可在37℃20min内对广州管圆线虫特异性DNA片段实现实时扩增。以含靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板时,该法最低检出限分别为10拷贝/μL重组质粒和100 pg/μL基因组DNA;以曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。结论成功建立了一种可用于广州管圆线虫核酸检...
【文章来源】：中国血吸虫病防治杂志. 2020,32(04)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
以广州管圆线虫基因组DNA为模板的荧光注：样本1
扩增。3.2以不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板随着基因组DNA浓度的降低，荧光RAA信号起峰时间逐渐延长；当广州管圆线虫基因组DNA浓度稀释至100pg/μL时，10min内仍可出现阳性扩增（图4），表明检测灵敏度可达100pg/μL。注：样本1、2均为广州管圆线虫基因组DNANote：Samples1and2arebothA.cantonensisgenomicDNA图2以广州管圆线虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果FigFig.2FluorescentRAAamplificationusingAA.cantonensisgenomicDNAastemplates图3以不同拷贝数重组质粒为模板的荧光RAA法检测结果FigFig.3FluorescentRAAassayusingdifferentcopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates图4以不同浓度基因组DNA为模板的荧光RAA法检测结果FigFig.4FluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofgenomicDNAastemplates4荧光RAA法检测特异性广州管圆线虫III期幼虫基因组DNA在5min内即可出现明显阳性扩增，而曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫成虫、细粒棘球绦虫幼虫、十二指肠钩口线虫钩蚴以及藁杆双脐螺、小管福寿螺螺体组织基因组DNA均无荧光值出现（图5），表明荧光RAA法检测广州管圆线虫具有良好特异性。图5荧光RAA法检测特异性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay讨论病原学技术依然是用于中间宿主和转续宿主体内广州管圆线虫幼虫检测的“金标准”，常用方法包括螺肺检法、人工消化法、匀浆法等［9］。螺肺检法和人工消化法对现场检测设备及环境条件要求低，但前者检出率较低，同时取螺肺过程也有一定操作难度；而后者操作过程多、检测耗时较长，故容易发生漏
中国血吸虫病防治杂志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4内即可出现阳性扩增。3.2以不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板随着基因组DNA浓度的降低，荧光RAA信号起峰时间逐渐延长；当广州管圆线虫基因组DNA浓度稀释至100pg/μL时，10min内仍可出现阳性扩增（图4），表明检测灵敏度可达100pg/μL。注：样本1、2均为广州管圆线虫基因组DNANote：Samples1and2arebothA.cantonensisgenomicDNA图2以广州管圆线虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果FigFig.2FluorescentRAAamplificationusingAA.cantonensisgenomicDNAastemplates图3以不同拷贝数重组质粒为模板的荧光RAA法检测结果FigFig.3FluorescentRAAassayusingdifferentcopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates图4以不同浓度基因组DNA为模板的荧光RAA法检测结果FigFig.4FluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofgenomicDNAastemplates4荧光RAA法检测特异性广州管圆线虫III期幼虫基因组DNA在5min内即可出现明显阳性扩增，而曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫成虫、细粒棘球绦虫幼虫、十二指肠钩口线虫钩蚴以及藁杆双脐螺、小管福寿螺螺体组织基因组DNA均无荧光值出现（图5），表明荧光RAA法检测广州管圆线虫具有良好特异性。图5荧光RAA法检测特异性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay讨论病原学技术依然是用于中间宿主和转续宿主体内广州管圆线虫幼虫检测的“金标准”，常用方法包括螺肺检法、人工消化法、匀浆法等［9］。螺肺检法和人工消化法对现场检测设备及环
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价[J]. 张强,丁昕,吴小珉,刘燕红,刘剑峰,徐祥珍,应清界,曹俊,戴洋. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(05)
[2]重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价[J]. 倪碧娴,吴小珉,刘燕红,徐祥珍,应清界,曹俊,戴洋. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(04)
[3]重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测日本血吸虫感染性钉螺[J]. 李婷,刘燕红,赵松,熊春蓉,董萱,张键锋,李伟,应清界,杨坤. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(02)
[4]广州管圆线虫感染致病机制的研究进展[J]. 廖瑶,孙希,吴忠道. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(01)
[5]等温扩增技术在寄生虫及其他病原体检测中的应用[J]. 李婷,杨坤. 中国血吸虫病防治杂志. 2018(02)
[6]高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫幼虫的初步研究[J]. 柯艳坤,黄裕,葛秀清,彭梅仙,汪清,黄立任,罗国强,钟雷响,阚式绂,张远新,翟建新. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2014(06)
[7]大理市1起食用螺肉引起的广州管圆线虫病暴发调查[J]. 陈凤,陈绍荣,李科荣,李庭华,方文,罗家军. 中国血吸虫病防治杂志. 2011(06)
[8]用多重PCR技术检测小管福寿螺体内广州管圆线虫幼虫[J]. 危芙蓉,刘和香,吕山,胡玲,张仪. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2010(05)
[9]PCR检测螺类感染广州管圆线虫方法的建立与应用[J]. 魏纪玲,周卫川,邵碧英,佘书生,王寿昆,陈文炳,陈寿铃. 中国人兽共患病学报. 2008(12)
[10]三种方法检测福寿螺肺囊内广州管圆线虫效果的比较研究[J]. 刘和香,张仪,吕山,朱丹,王显红,胡铃,周晓农. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2007(01)
本文编号：3300875
【文章来源】：中国血吸虫病防治杂志. 2020,32(04)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
以广州管圆线虫基因组DNA为模板的荧光注：样本1
扩增。3.2以不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板随着基因组DNA浓度的降低，荧光RAA信号起峰时间逐渐延长；当广州管圆线虫基因组DNA浓度稀释至100pg/μL时，10min内仍可出现阳性扩增（图4），表明检测灵敏度可达100pg/μL。注：样本1、2均为广州管圆线虫基因组DNANote：Samples1and2arebothA.cantonensisgenomicDNA图2以广州管圆线虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果FigFig.2FluorescentRAAamplificationusingAA.cantonensisgenomicDNAastemplates图3以不同拷贝数重组质粒为模板的荧光RAA法检测结果FigFig.3FluorescentRAAassayusingdifferentcopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates图4以不同浓度基因组DNA为模板的荧光RAA法检测结果FigFig.4FluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofgenomicDNAastemplates4荧光RAA法检测特异性广州管圆线虫III期幼虫基因组DNA在5min内即可出现明显阳性扩增，而曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫成虫、细粒棘球绦虫幼虫、十二指肠钩口线虫钩蚴以及藁杆双脐螺、小管福寿螺螺体组织基因组DNA均无荧光值出现（图5），表明荧光RAA法检测广州管圆线虫具有良好特异性。图5荧光RAA法检测特异性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay讨论病原学技术依然是用于中间宿主和转续宿主体内广州管圆线虫幼虫检测的“金标准”，常用方法包括螺肺检法、人工消化法、匀浆法等［9］。螺肺检法和人工消化法对现场检测设备及环境条件要求低，但前者检出率较低，同时取螺肺过程也有一定操作难度；而后者操作过程多、检测耗时较长，故容易发生漏
中国血吸虫病防治杂志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4内即可出现阳性扩增。3.2以不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板随着基因组DNA浓度的降低，荧光RAA信号起峰时间逐渐延长；当广州管圆线虫基因组DNA浓度稀释至100pg/μL时，10min内仍可出现阳性扩增（图4），表明检测灵敏度可达100pg/μL。注：样本1、2均为广州管圆线虫基因组DNANote：Samples1and2arebothA.cantonensisgenomicDNA图2以广州管圆线虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果FigFig.2FluorescentRAAamplificationusingAA.cantonensisgenomicDNAastemplates图3以不同拷贝数重组质粒为模板的荧光RAA法检测结果FigFig.3FluorescentRAAassayusingdifferentcopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates图4以不同浓度基因组DNA为模板的荧光RAA法检测结果FigFig.4FluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofgenomicDNAastemplates4荧光RAA法检测特异性广州管圆线虫III期幼虫基因组DNA在5min内即可出现明显阳性扩增，而曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫成虫、细粒棘球绦虫幼虫、十二指肠钩口线虫钩蚴以及藁杆双脐螺、小管福寿螺螺体组织基因组DNA均无荧光值出现（图5），表明荧光RAA法检测广州管圆线虫具有良好特异性。图5荧光RAA法检测特异性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay讨论病原学技术依然是用于中间宿主和转续宿主体内广州管圆线虫幼虫检测的“金标准”，常用方法包括螺肺检法、人工消化法、匀浆法等［9］。螺肺检法和人工消化法对现场检测设备及环
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价[J]. 张强,丁昕,吴小珉,刘燕红,刘剑峰,徐祥珍,应清界,曹俊,戴洋. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(05)
[2]重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增方法的建立及评价[J]. 倪碧娴,吴小珉,刘燕红,徐祥珍,应清界,曹俊,戴洋. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(04)
[3]重组酶介导的核酸等温扩增荧光法快速检测日本血吸虫感染性钉螺[J]. 李婷,刘燕红,赵松,熊春蓉,董萱,张键锋,李伟,应清界,杨坤. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(02)
[4]广州管圆线虫感染致病机制的研究进展[J]. 廖瑶,孙希,吴忠道. 中国血吸虫病防治杂志. 2019(01)
[5]等温扩增技术在寄生虫及其他病原体检测中的应用[J]. 李婷,杨坤. 中国血吸虫病防治杂志. 2018(02)
[6]高分辨率熔解曲线法检测广州管圆线虫幼虫的初步研究[J]. 柯艳坤,黄裕,葛秀清,彭梅仙,汪清,黄立任,罗国强,钟雷响,阚式绂,张远新,翟建新. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2014(06)
[7]大理市1起食用螺肉引起的广州管圆线虫病暴发调查[J]. 陈凤,陈绍荣,李科荣,李庭华,方文,罗家军. 中国血吸虫病防治杂志. 2011(06)
[8]用多重PCR技术检测小管福寿螺体内广州管圆线虫幼虫[J]. 危芙蓉,刘和香,吕山,胡玲,张仪. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2010(05)
[9]PCR检测螺类感染广州管圆线虫方法的建立与应用[J]. 魏纪玲,周卫川,邵碧英,佘书生,王寿昆,陈文炳,陈寿铃. 中国人兽共患病学报. 2008(12)
[10]三种方法检测福寿螺肺囊内广州管圆线虫效果的比较研究[J]. 刘和香,张仪,吕山,朱丹,王显红,胡铃,周晓农. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2007(01)
本文编号：3300875
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