蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫双重荧光定量PCR两步法检测技术的建立

发布时间：2021-08-01 20:32

　　目的建立同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫的双重荧光定量PCR两步检测方法。方法针对蓝氏贾第鞭毛虫的gdh基因和微小隐孢子虫的cowp基因分别设计特异性引物和TaqMan探针。优化引物和探针浓度后,确定反应体系和反应条件,对其灵敏度、特异性、稳定性和重复性进行评价。通过与金标层析法进行医源性腹泻样本检测的比较评估该方法的实际应用价值。结果该方法能特异地检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,对其它非目标虫种均不产生扩增曲线,特异性良好。对阳性质粒pMD^TM19-T-GIA和pMD^TM19-T-CRY同时定量扩增的敏感度分别为45.1 copies/μL和52.8 copies/μL;阳性质粒标准品的标准曲线在10⁹ copies/μL～10¹ copies/μL之间线性关系良好（R²=0.99）,批内和批间重复实验的变异系数均小于5%。该方法与金标层析法具有较好的一致性。结论建立的双重荧光定量PCR两步法可快速、灵敏、特异地同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,具有较好的实际应用价... 

【文章来源】：中国人兽共患病学报. 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

蓝氏贾第鞭毛虫特异性引物(GIA-F/R)和探针(GIA-P)的浓度优化结果

微小隐孢子虫特异性引物(CRY-F/R)和探针(CRY-P)的浓度优化结果

根据2.2引物和探针浓度优化的结果,最终确定双重FQ-PCR体系,体系组分包括:Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 10 μL、GIA-F(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-R(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-F(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-R(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-P(10 μmol/L) 0.6 μL、CRY-P(10 μmol/L) 0.6 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、两虫DNA模板各2 μL,DEPC H2O补足体积至20 μL。用双重FQ-PCR体系检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫样本的结果见图3,结果表明该体系能同时检测两虫或任意一种虫种。2.4 双重FQ-PCR体系的灵敏度和标准曲线

【参考文献】：
期刊论文
[1]隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫分子流行病学研究进展[J]. 徐宁,尹建海,沈玉娟,刘华,曹建平.  中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2018(06)
[2]贾第虫和隐孢子虫检测及灭活方法研究现状[J]. 方远航,李嘉妮.  辽宁化工. 2017(04)
[3]武汉市腹泻婴幼儿隐孢子虫感染的分子流行病学调查[J]. 刘晓洁,毛铁波,吴鹏,周蕊.  中国血吸虫病防治杂志. 2017(02)
[4]两种检测方法应用于城市水源中蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫污染的比较研究[J]. 张小萍,朱倩,蒋守富,江莉,何艳燕,张耀光,王真瑜.  国际医学寄生虫病杂志. 2015 (06)
[5]C2株蓝氏贾第鞭毛虫SUMO特异性蛋白酶基因的克隆、生物信息学分析及其催化活性区的原核表达[J]. 李少东,周英斌,刘晓莉,禇晗,李思瑾,田喜凤,王洋.  中国人兽共患病学报. 2015(03)
[6]实时荧光PCR检测蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫方法的建立[J]. 杨晓华,侯炎昌.  热带医学杂志. 2013(06)
[7]上海市饮用水和环境水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫污染状况调查[J]. 张小萍,何艳燕,朱倩,马晓疆,蔡黎.  中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2010(06)

硕士论文
[1]实验用牛、羊贾第虫与隐孢子虫多重PCR方法的建立与应用[D]. 高宇航.吉林大学 2018



本文编号：3316201