论文一：V型并指（趾）小鼠模型建立及形态学分析 论文二：成骨不全症致病突变谱研究

发布时间：2017-04-30 17:08

  本文关键词：论文一：V型并指（趾）小鼠模型建立及形态学分析 论文二：成骨不全症致病突变谱研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：并指是一种因肢端发育期间相邻的手指和/或脚趾间的连接无法正常分离,而引起的肢端畸形。并指是一种最常见的遗传性肢端畸形,新生儿中的发病率为0.30‰-1‰。其中V型并指患者手部畸形特征表现为4-5掌骨融合,其它主要表现为2-5指尺侧偏位及远节指骨短小、3-4或4-5并指、第5指短小或弯曲、屈指和中远指节间关节褶消失；足部畸形共同表现为：趾骨外翻,跖骨内翻,第1趾(跖)骨粗大,第2-5趾(跖)骨发育不良,第5趾(跖)骨短。V型并指呈常染色体显性遗传,在本课题组的早期工作中,曾在一个中国人v型并指大家系中发现了HOXD13基因内的一个错义突变。在这个V型并指家系中,所有患者存在HOXD13基因内错义突变c.950AG(Q317R)；该突变位于HOXD13蛋白的同源结构域(Homeobox domain, HD)内,导致HD第50位的谷氨酰胺变为精氨酸。体外实验表明该突变导致其与DNA特异性结合能力的下降。HOXD13是同源盒转录因子家族(HOX基因家族)的重要成员之一,在脊椎动物胚胎发育的模式形成中具有重要作用。本研究在前期工作的基础上以HOXD13基因突变Q50R为切入点,借助TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)技术构建Hoxd13Q50R突变体小鼠模型,拟通过对模型小鼠进行表型分析及分子生物学分析,明确Hoxd13基因突变与肢端畸形的相关性,阐明V型SD的致病机制。目前,外观观察和骨骼CT结果显示Hoxd13Q50R杂合、纯合突变小鼠肢端外形和骨骼形态均有明显畸形,说明HOXD13基因内HD-Q50R突变是导致人V型并指(趾)的致病原因。成骨不全症俗称脆骨病。成骨不全患者的骨骼较脆弱易骨折,但表型的严重性有显著差异。成骨不全还具有骨骼畸形、牙本质发育不全、耳聋及浅灰色或蓝色巩膜等表型。目前,已知的成骨不全症致病基因共有十三种,90%以上的OI患者由编码Ⅰ型胶原的COL1A1和COL1A2的杂合突变引起。剩下患者可能的致病原因有：某些基因中的致病改变引起了骨骼过度矿化或矿化不足,或影响了Ⅰ型胶原的转录后修饰、折叠、分泌、加工,还有可能是因成骨细胞发育有关的基因出现了致病改变。本研究中综合运用PCR-DNA测序、二代测序、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对成骨不全症致病基因进行突变研究。酚/氯仿法提取先证者、家系成员外周全血基因组DNA,二代测序或PCR扩增COL1A/A2编码区及外显子/内含子交界区,PCR产物进行sanger测序。对于未发现突变的患者考虑拷贝数变异,利用MLPA技术(P271/P272)对COL1A1/A2进行重复和缺失突变筛查。最后,对COL1A1/A2也未检测到拷贝数变异的患者,对成骨不全隐性致病基因进行PCR-sanger测序筛查突变。本研究中,我们共在200例成骨不全症家系中,检出COL1A1/A2点突变及微缺失突变132例(COL1A1突变78例,COL1A2突变54例),其中通过二代测序方法筛查出突变46例,PCR-sanger测序法筛查出突变84例。突变类型多为以甘氨酸突变为主的错义突变、无义突变和剪接位点突变。利用MLPA技术发现大片段缺失突变两例。隐性基因WNT1中发现c.397GA (Ala133Thr)/c.677CT (Ser226Leu)复合杂合突变一个。运用多种技术构建成骨不全症筛查平台,能有效提高成骨不全症致病突变检出率,实验结果丰富了中国人成骨不全症突变谱。
【关键词】：V型并指(趾) Hoxd13基因 基因突变 转录激活因子样效应物核酸酶 成骨不全症 二代测序 sanger测序 多重连接探针扩增技术
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R682.15;R-332
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 第一部分 V型并指(趾)小鼠模型的建立及形态学分析9-34
• 一、前言9-12
• 二、材料与方法12-24
• 1. 实验材料12-14
• 1.1. 主要仪器设备12-13
• 1.2. 主要试剂及试剂盒13-14
• 2. 实验方法14-24
• 2.1. 利用TALEN技术构建Hoxd13Q50R突变小鼠模型14-20
• 2.2. F0代小鼠Hoxd13同源基因脱靶效应的排除20-22
• 2.3. 小鼠种系传递22-23
• 2.4. PET-CT实验过程23-24
• 三、结果24-29
• 1. FO代阳性突变鼠的鉴定结果24-25
• 1.1. 基因组DNA-PCR琼脂糖凝胶电泳24
• 1.2. PCR产物酶切鉴定24-25
• 2. F1代小鼠测序结果分析25-26
• 2.1. 基因组DNA PCR琼脂糖凝胶电泳25
• 2.2. PCR产物酶切鉴定25-26
• 3. F0代小鼠Hoxd13同源基因脱靶效应的排除结果26-27
• 4. 表型分析27-29
• 4.1. 外观分析27-28
• 4.2. 骨骼分析28-29
• 四、讨论29-31
• 五、小结31-32
• 六、参考文献32-34
• 第二部分：成骨不全症致病突变谱研究34-70
• 一、前言34-35
• 二、材料与方法35-61
• 1. 实验材料35-38
• 1.1. 研究对象35
• 1.2. 主要仪器设备和试剂材料35-38
• 2. 实验方法38-61
• 2.1. 家系调查及样本采集38
• 2.2. 基因组DNA的提取38
• 2.3. COL1A1/COL1A2基因的点突变筛查38-42
• 2.4. Ion Torrent下一代测序平台筛查COL1A1和COL1A2基因突变42-54
• 2.5. COL1A1/COL1A2基因的拷贝数变异检查54-55
• 2.6. OI相关隐性基因的突变检测55-61
• 三、实验结果61-65
• 1. COL1A1/COL1A2测序结果分析61
• 2. MLPA筛查COL1A1和COL1A2拷贝数变异结果61-63
• 3. 成骨不全症隐性基因测序结果分析63-65
• 四、讨论65-67
• 五、小结67-68
• 六、参考文献68-70
• 致谢70-71
• 附录一 英汉名词对照及缩写71-73
• 附录二：分析软件及常用网址73-74
• 非Ⅰ型胶原成骨不全症致病基因综述74-80
• 参考文献78-80
• 个人简介80-81

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本文编号：337244