纳米颗粒介导CRISPR/Cas9基因编辑干预巨噬和树突状细胞功能的研究

发布时间：2021-09-28 11:20

　　巨噬细胞、树突状细胞是构成机体免疫系统的关键部分,是抵御病原体入侵、维持机体健康稳态的主要细胞之一。巨噬细胞是机体炎症反应和先天性免疫反应中关键的效应细胞和调节细胞;树突状细胞启动并调节高度病原特应性的适应性免疫反应,也是产生免疫记忆和免疫耐受的关键。巨噬细胞以及树突状细胞与多种疾病的发生、发展息息相关。如肿瘤相关巨噬细胞可以分泌多种细胞因子等促进肿瘤发展、转移;Ⅱ型糖尿病脂肪组织中募集的巨噬细胞分泌炎性细胞因子,导致胰岛素抵抗;树突状细胞提呈自身抗原时,激活自身反应性淋巴细胞,导致机体免疫失衡,导致自身免疫疾病发生。干预这两种细胞的功能,将有助于疾病的治疗。本论文基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,利用阳离子脂质辅助的PEG-b-PLGA聚合物纳米颗粒（CLAN）载药体系,制备包载CRISPR/Cas9核酸药物,分别靶向巨噬细胞和树突状细胞,研究其对巨噬细胞和树突状细胞功能的干预,以及对于相关疾病治疗的效果。本论文的研究工作主要分为两部分:1.CRISPR/Cas9基因编辑工具有望用于治疗多种疾病,我们构建了巨噬细胞特异性启动子启动的Cas9质粒系统,并且利用CLAN技术包载该质... 

【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：117 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 巨噬细胞和树突状细胞的功能与疾病发生
        1.1.1 巨噬细胞和树突状细胞简介
        1.1.2 巨噬细胞和树突状细胞的功能
        1.1.3 巨噬细胞和树突状细胞与疾病的发生
    1.2 巨噬细胞和树突状细胞的功能干预与疾病治疗
        1.2.1 抗体
        1.2.2 免疫调节剂
        1.2.3 细胞疗法
    1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术
        1.3.1 基因编辑技术介绍
        1.3.2 CRISPR/Cas9的分类与应用
        1.3.3 CRISPR/Cas9的递送与疾病治疗
    1.4 核酸纳米药物递送系统
        1.4.1 核酸药物递送的障碍
        1.4.2 核酸纳米药物递送系统的分类
        1.4.3 核酸纳米药物递送系统与免疫细胞功能干预
    1.5 选题依据及主要研究内容
    参考文献
第二章 CLAN纳米颗粒介导巨噬细胞特异性基因编辑的研究
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 主要材料
        2.2.2 细胞与动物
        2.2.3 主要药品及试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 巨噬细胞特异性基因编辑质粒的设计和构建
        2.3.2 包载CRISPR/Cas9质粒系的纳米颗粒(CLAN)的制备
        2.3.3 CLAN对siRNA及CRISPR/Cas9质粒的包封率、回收率的测定
        2.3.4 CLAN纳米颗粒粒径及表面电势的表征
        2.3.5 CLAN纳米颗粒的形态表征
        2.3.6 检测不同细胞对CLAN_(Cy5-siRNA)摄取能力
        2.3.7 检测不同细胞转染CLAN_(pM458)后Cas9和EGFP的表达
        2.3.8 检测体内不同的免疫细胞对CLANC_(y5-siRNA)的摄取能力
        2.3.9 检测CLAN_(pM458)在小鼠体内单核巨噬细胞中EGFP和Cas9的表达
        2.3.10 检测CLAN_(pM330/sgNtn1)对巨噬细胞Ntn1基因的敲除效率
        2.3.11 建立高脂饮食诱导Ⅱ型糖尿病(T2D)小鼠模型
        2.3.12 CLAN_(pM330/sgNtn1)针对T2D疾病模型小鼠的治疗
        2.3.13 检测CLAN_(pM330/sgNtn1)治疗结束后Ntn1基因的敲除效率
        2.3.14 检测CLAN_(pM330/sgNtn1)治疗结束后脂肪组织中netrin-1的表达
        2.3.15 检测CLAN_(pM330/sgNtn1)治疗结束后潜在的脱靶效应
        2.3.16 检测CLAN_(pM330/sgNtn1)治疗结束后IL-6和TNF-α表达
        2.3.17 检测CLAN_(pM330/sgNtn1)治疗结束后脂肪组织中巨噬细胞的浸润
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 巨噬细胞特异性CD68启动子启动的CRISPR/Cas9质粒的构建
        2.4.2 巨噬细胞特异性CD68启动子启动的CRISPR/Cas9质粒的鉴定
        2.4.3 CLAN纳米颗粒的制备及表征
        2.4.4 CLAN纳米颗粒包载CRISPR/Cas9质粒在细胞水平的转染效果
        2.4.5 体外验证CD68启动子启动的Cas9-EGFP在巨噬细胞中特异性表达
        2.4.6 体内验证CD68启动子启动的Cas9-EGFP在巨噬细胞中特异性表达
        2.4.7 CLAN_(pM330/sgNtn1)敲除Ntn1基因的效率检测
        2.4.8 CLAN_(pM330/sgNtn1)对T2D疾病小鼠模型的治疗效果
        2.4.9 CLAN_(pM330/sgNtn1)治疗后细胞因子分泌、脂肪组织巨噬细胞滞留情况表征
        2.4.10 CLAN_(pM330/sgNtn1)治疗后脱靶效应评估
    2.5 本章小结
    参考文献
第三章 CLAN纳米颗粒递送CRISPR/Cas9及抗原肽干预树突状细胞功能的研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 主要材料
        3.2.2 细胞和动物
        3.2.3 主要药品及试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 靶向CD80、CD86和CD40的CRISPR/Cas9质粒的构建
        3.3.2 体外转录靶向CD80、CD86以及CD40的gRNA
        3.3.3 包载CRIPSR/Cas9质粒以及抗原肽的CLAN纳米颗粒的制备及表征
        3.3.4 检测CLAN纳米颗粒递送质粒和抗原肽至BMDC的能力
        3.3.5 检测CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)对BMDC共刺激分子的敲除效率
        3.3.6 检测CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)转染后BMDC对抗原肽的提呈
        3.3.7 小鼠CD4~+T细胞分离培养
        3.3.8 检测CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)转染后BMDC与T细胞的作用
        3.3.9 检测CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)在体内对共刺激分子的敲除效率
        3.3.10 检测CLAN_(pCas9/gCD80,86,40)对体内树突状细胞的编辑效率
        3.3.11 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)对T1D疾病小鼠模型的治疗
        3.3.12 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治疗结束后胰腺组织病理学的分析胰腺组织学分析
        3.3.13 检测CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治疗结束后小鼠T细胞亚群的变化
        3.3.14 检测CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治疗结束后细胞因子分泌
    3.4 实验结果
        3.4.1 体外转录CD80 gRNA、CD86 gRNA、CD40 gRNA
        3.4.2 CLAN纳米颗粒的制备和表征
        3.4.3 BMDC对包载CRISPR/Cas9和抗原肽的CLAN纳米颗粒的摄取
        3.4.4 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)转染BMDC后的基因编辑效率以及抗原的提呈
        3.4.5 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)转染BMDC后对T细胞的抗原提呈
        3.4.6 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40)对体内树突状细胞的基因编辑
        3.4.7 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)对T1D疾病小鼠模型的治疗
        3.4.8 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治疗后T1D小鼠抗原特异性Treg细胞的产生
        3.4.9 CLAN_(pCas9/gCD80,86,40/2.5mi)治疗后T1D小鼠炎症细胞因子的分泌
    3.5 本章总结
    参考文献
附录一 主要仪器设备
附录二 常规试剂
附录三 常用试剂的准备
附录四 常规实验方法
致谢
在读期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3411800