利用CRISPR/Cas9系统建立叉头框G1基因敲除的人胚胎干细胞系

发布时间：2021-09-30 21:06

　　目的采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术构建叉头框G1（FOXG1）基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个向导RNA（gRNA）诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除,经单克隆筛选、测序分析和蛋白质印迹分析验证获得FOXG1基因敲除的人胚胎干细胞;通过细胞免疫荧光染色、qRT-PCR检测FOXG1基因敲除前后细胞在早期神经诱导过程中关键标志物配对框基因6（PAX6）、性别决定区Y框蛋白2（SOX2）和正小齿同源物2（OTX2）的表达。结果利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干细胞,细胞免疫荧光染色、qRT-PCR结果均显示人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的关键标志物PAX6、SOX2和OTX2的表达并未受FOXG1缺失的影响。结论通过2个gRNA共转染可以快捷地诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影响人胚胎干细胞的早期神经诱导。 

【文章来源】：第二军医大学学报. 2020,41(05)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

gRNA及基因型鉴定引物在FOXG1 mRNA序列中的位置示意图

进一步使用3对引物对诱导后细胞FOXG1基因表达进行了RT-PCR检测,引物位置见图1。引物组合P1+/P3-在gRNA敲除片段的两侧,RT-PCR结果显示诱导前的C9细胞和对照hESC(H1细胞)中均不表达FOXG1;而神经诱导后均可以检测到FOXG1的表达,H1 细胞的PCR产物为550 bp,但C9细胞FOXG1的扩增片段显著截短,PCR产物大小为240 bp。引物P2+和P2-均位于2条gRNA的编辑区域内,使用引物组合P1+/P2-和P2+/P3-进行RT-PCR,仅能在神经诱导后的H1细胞中检测到FOXG1的表达条带,大小分别为500 bp和300 bp(图 5)。结果进一步证明C9克隆发生了FOXG1基因的大片段剪切编辑。3 讨 论

既往研究发现FOXG1基因敲除小鼠出生后即死亡,大脑半球发育异常、体积较野生型小鼠显著减小,尤其是腹侧前脑几乎缺失[6]。本研究借助人PSC研究FOXG1基因在体外神经诱导和分化中的作用,利用改进的双重Smad抑制诱导人PSC的神经分化,该方法可以在7 d内高度均一地将人PSC诱导分化为类似于发育过程中的神经板细胞,但是结果显示FOXG1基因敲除并没有显著影响SOX2、 PAX6和CTX2等基因的表达。SOX2既是PSC的标志分子,也是早期神经发生的关键基因;转录因子PAX6是人神经外胚层最早表达的核心分子[10];OTX2是前中脑的标志分子。发生这种体外和体内基因缺失后表型不吻合的可能原因是体外二维的神经诱导环境无法忠实地模拟体内三维的组织发生过程,因此有必要利用PSC的神经类器官分化体系进一步研究FOXG1对三维条件下神经诱导的影响。此外,FOXG1基因敲除是否会影响后期神经板细胞在神经发育前后轴和背腹轴上的区域化及神经元的分化有待进一步研究。


本文编号：3416638