pTWIN1-EgAgB8/3自剪切融合蛋白原核表达载体的构建及表达

发布时间：2021-10-16 14:10

　　目的表达获得较纯的细粒棘球绦虫AgB8/3重组抗原（rEgAgB8/3）。方法根据GeneBank登陆号（AF362442）下载目的基因核酸序列,利用DNAman软件设计引物,对EgAgB8/3编码分泌型多肽片段的核酸序列进行PCR扩增,测序鉴定其正确性后定向连入原核表达质粒pTWIN1上,并转化至大肠杆菌ER2566,IPTG诱导表达CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白后进行纯化,用SDS-PAGE电泳和western blot分析鉴定融合蛋白与目的蛋白rEgAgB8/3的表达量和纯度。结果成功克隆获得EgAgB8/3基因目的片段和具有蛋白自剪切功能的重组表达载体pTWIN1-EgAgB8/3,并鉴定其表达的融合蛋白主要以可溶形式存在;构建的重组载体中融合标签的几丁质结合域（CBD）和内含肽（intein1）分别使亲和层析纯化和融合标签自剪切一步完成。结论成功的构建重组表达载体pTWIN1-EgAgB8/3,获得高表达融合蛋白CBD-intein1-EgAgB8/3,并经简单后续处理即可获得含极少任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白rEgAgB8/3,尽可能保证了其原有的结构和... 

【文章来源】：中国人兽共患病学报. 2013,29(02)北大核心CSCD

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【部分图文】：

图１ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＥｇＡｇＢ８／３

ＥｇＡｇＢ８／３原核表达质粒的鉴定双酶切ｐＥＡＳＹ－Ｔ１－ＥｇＡｇＢ８／３重组质粒和ｐＴＷＩＮ１表达质粒，并切胶回收ＥｇＡｇＢ８／３目的基因和ｐＴＷＩＮ１线性化的载体大片段，Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，定向克隆构建ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３原核表达质粒，经转化、培养、小量提取质粒后，用ＰＣＲ法及ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ双酶切ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３原核表达质粒均可得到２０７ｂｐ的ＤＮＡ片段，与预期产物一致（图２）。图２重组质粒ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲ及酶切鉴定结果Ｆｉｇ．２ＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙＰＣＲａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ：ＤＬ１００００ＤＮＡｍａｋｅｒ；１－２：ＥｇＡｇＢ８／３ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ；３：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｄｉｇｅｓ－ｔｅｄｂｙＥｃｏＲＩａｎｄＢａｍＨＩ２．４ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白的表达纯化１５６

２期张瑞妮等：ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３自剪切融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定将ｐＴＷＩＮ１－ＥｇＡｇＢ８／３重组质粒转化入ＥｇＡｇＢ８／３－Ｅ．ｃｏｌｉＥＲ２５６６感受态细胞中，接种培养后诱导４ｈ，菌液超声离心后分别取上清和沉淀（图３第３条泳道和第４条泳道）作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见在３３ｋＤａ处出现明显的普带，说明融合蛋白已成功表达并为可溶性蛋白，通过融合蛋白Ｎ末端融合的ＣＢＤ蛋白吸附于几丁质柱上，并在蛋白质成熟加工过程中自行剪切去除，获得高纯度目的蛋白ｒＥｇＡｇＢ８／３（如图３第６、７、８泳道），图３第５泳道为纯化时超声后上清蛋白样品通过几丁质树脂结合后流出的样品，在３３ｋＤａ处没有融合蛋白条带，可见几丁质结合ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白的效率几乎为１００％。２．５ＣＢＤ－ｉｎｔｅｉｎ１－ＥｇＡｇＢ８／３融合蛋白和目的蛋白ｒＥｇＡｇＢ８／３的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定对表达后的融合蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定，可以看到在３０ｋＤａ处有两条清晰的特异性条带，一条为３３ＫＤａ的重组蛋白，另一条为降解了的蛋白片段（图４ａ），对纯化后得到ｒＥｇＡｇＢ８／３蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定，可看到８ｋＤａ处有清晰的唯一的特异性条带（图４ｂ）。图３融合蛋白的表达纯化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析图谱Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＭ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕ


本文编号：3439948