中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）结构蛋白和附属蛋白拮抗干扰素和诱导自噬的功能研究

发布时间：2021-10-21 21:23

　　中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV （Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus）是一种新发的高致病性冠状病毒,感染之后能够引起严重的呼吸系统疾病,有时还伴有肾衰竭。截止到2015年6月6号,全球共确诊了1190个病例,其中444例死亡,病死率接近40%。虽然目前还没有确切的实验室证据表明该病毒能够在人际间传播,但是动物检测研究结果、流行病学研究和基因组分析提示该病毒有很大的可能性能够在人际间传播且存在大暴发的可能。目前尚无针对该病毒的疫苗和特异性抗病毒药物,了解其致病和免疫保护或逃逸机制对于发现抗该病毒的药物靶标有着重要的理论意义。干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫反应是宿主抵抗病毒入侵的第一道防线,在病毒感染早期发挥着非常重要的抗病毒作用,而病毒在其感染过程中也能够通过其自身编码的病毒蛋白抑制宿主的天然免疫反应而发生天然免疫逃逸；细胞自噬是真核生物中广泛存在的一种溶酶体依赖性的降解途径,不同病毒可通过其编码蛋白诱导或者抑制宿主细胞自噬的发生来发挥重要的抗病毒和促病毒作用。研究表明,MERS-CoV感染之后并不能诱导机体产生强的Ⅰ/Ⅲ型干... 

【文章来源】：中国疾病预防控制中心北京市

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略词
前言
    1. 病毒感染与天然免疫
        1.1 天然免疫概述
        1.2 TLRs及其信号转导通路
        1.3 RLRs及其信号转导通路
        1.4 NLRs及其信号转导通路
        1.5 病毒逃避天然免疫的机制研究进展
    2. 病毒感染与细胞自噬
        2.1 自噬概述
        2.2 自噬的研究方法
            2.2.1 观察自噬体的形成
            2.2.2 自噬流的监测
        2.3 病毒感染与自噬
            2.3.1 病毒感染抑制细胞自噬,促进自身复制
            2.3.2 病毒感染诱导细胞自噬,促进自身复制
    3. 自噬与天然免疫
    4、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)
        4.1 MERS-CoV概述
        4.2 MERS-CoV与天然免疫
    5、研究目的及意义
材料方法
    1. 材料
        1.1 质粒
        1.2 细胞系及病毒毒株
        1.3 抗体
        1.4 主要试剂
        1.5 主要仪器设备
        1.6 常用溶液
    2. 方法
        2.1 细胞培养
        2.2 表达质粒构建
        2.3 SDS-PAGE以及Western-blot鉴定
        2.4 免疫荧光和激光共聚焦实验
        2.5 双荧光素酶报告基因检测
        2.6 半定量RT-PCR(reverse transcription-PCR)
        2.7 免疫共沉淀
结果
    第一部分 MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白的表达和亚细胞定位
        1.1 MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白表达质粒的构建与表达验证
        1.2 MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白的亚细胞定位
        1.3 讨论
        1.4 小结
    第二部分 MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白拮抗干扰素功能的筛选及机制研究
        2.1 MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白拮抗干扰素功能的筛选
            2.1.1 ORF4a,ORF4b,ORF5,以及M蛋白具有拮抗Ⅰ型干扰素的功能
            2.1.2 ORF4a,ORF4b,ORF5以及M蛋白能抑制IRF-3的功能,同时ORF4a还能抑制NF-κB的激活
            2.1.3 ORF4a,ORF 4b以及M蛋白能够抑制干扰素信号转导
            2.1.4 讨论
            2.1.5 小结
        2.2 ORF4b抑制Ⅰ型干扰素的机制研究
            2.2.1 ORF 4b为核定位蛋白,能够抑制Ⅰ型干扰素反应
            2.2.2 ORF 4b与MDA5、IKKε、TBK1相互作用
            2.2.3 ORF4b能够抑制过表达RIG-I,MDA5,MAVS,IKKε,TBK-1以及IRF-3诱导的Ⅰ型干扰素反应
            2.2.4 缺失核定位信号后ORF4b不能够抑制IRF3诱导的Ⅰ型干扰素反应
            2.2.5 ORF4b不影响MDA5与MAVS的结合
            2.2.6 ORF4b能够抑制IKKε/TBK1诱导的IRF3磷酸化和入核
            2.2.7 ORF4b不影响IKK-TBK1与其磷酸化底物IRF3/IRF7的结合
            2.2.8 ORF4b能够抑制IKK8与MAVS的结合
            2.2.9 讨论
            2.2.10 小结
    第三部分 MERS-CoV结构蛋白和附属蛋白诱导细胞自噬的功能研究
        3.1 MERS-CoV结构蛋白E和M能够诱导自噬体的聚集
        3.2 MERS-CoV结构蛋白E和M能够诱导不完全自噬
            3.2.1 E蛋白和M蛋白对自噬性底物p62表达水平无明显影响
            3.2.2 LC3 turnover实验
            3.2.3 mRFP-GFP-LC3呈递实验和GFP-LC3与LAMPl共定位实验
        3.3 MERS-CoV结构蛋白E和M能够激活IRE1-XBP1通路
        3.4 MERS-CoV结构蛋白E和M诱导的自噬不依赖mTOR/4E-BP1和mTOR/S6K通路
        3.5 讨论
        3.6 小结
全文总结
参考文献
发表综述
    参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3449737