人巨细胞病毒gH蛋白表达及其单克隆抗体的制备

发布时间：2021-11-04 15:01

　　人巨细胞病毒（HCMV）是全球范围内普遍感染的一种疱疹病毒,也是引起胎儿先天性畸形和器官移植受者死亡最常见的病原体。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原,特异性抗gH抗体具有中和HCMV及阻断病毒在细胞间传播的潜力。本研究以含人巨细胞病毒临床株Toledo全基因组的细菌人工染色体（BAC）为模板,扩增去除信号肽和跨膜区的gH基因片段,并将其插入表达载体构建pET32a’-gH重组表达质粒,将序列鉴定正确的重组质粒转化进入表达菌株TransB,诱导重组蛋白表达。用纯化的重组gH蛋白免疫8周龄BALB/c雄鼠,经杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗gH单克隆抗体的细胞株,分别命名为8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所获5株单克隆抗体对gH蛋白均具有良好的反应性,其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕获能力,且8D9和8D12的捕获能力较强。本研究获得了具有自主知识产权的抗gH单克隆抗体,抗体具有良好的病毒捕获能力。在此基础上,我们将进一步鉴定其是否为中和抗体,为今后开发治疗HCMV感染的中和抗体奠定基础。 

【文章来源】：激光生物学报. 2020,29(03)

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

重组表达质粒pET32a"-gH的构建

将构建成功的重组质粒转化TransB菌株，并用IPTG诱导蛋白表达。分别留取IPTG诱导前后的蛋白样，并通过SDS-PAGE、WB鉴定蛋白表达情况。SDS-PAGE结果显示，与诱导前相比，诱导后的重组菌株表达了一个约70 kD的蛋白(图2a)。为验证诱导表达蛋白是否为gH蛋白，我们以抗6×His-tag抗体作为一抗，使用WB对重组蛋白的表达情况进行鉴定，结果显示，经IPTG诱导的表达菌株在70 kD处出现了特异性条带，而对照菌株中没有出现(图2b)，提示菌株所表达的70 kD蛋白处为含有6×Histag的重组蛋白。超声波破碎后经IPTG诱导的重组表达菌株，SDS-PAGE结果显示，重组蛋白主要存在于沉淀中，说明该蛋白主要以包涵体的形式表达(图2a)。使用WB对重组蛋白的表达情况进行鉴定，与SDS-PAGE结果一致(图2b)。大量表达gH，收集沉淀，后者经洗涤、尿素变性后，用电洗脱方法进行纯化，收集纯化前后的蛋白样，并通过SDS-PAGE和WB鉴定gH纯化情况(图3)。结果显示:与纯化前相比，纯化后gH仅有1条较亮的条带，gH重组蛋白纯化率达90%以上，达到免疫小鼠制备单克隆抗体的要求。图3 重组gH蛋白的纯化鉴定

重组gH蛋白的纯化鉴定

【参考文献】：
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本文编号：3475964