超抗原SEB疫苗rS-H的研制及其免疫效果研究

发布时间：2017-05-06 04:07

  本文关键词：超抗原SEB疫苗rS-H的研制及其免疫效果研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金黄色葡萄球菌是引起人类食物中毒、软组织与骨组织感染以及致命性中毒性休克中的罪魁祸首,这种常见的细菌可以合成包括金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)在内的多种多样的毒力因子,该超抗原在皮摩尔浓度水平下就能够直接与抗原递呈细胞上的II类主要组织相容性复合体分子(MHC II)以及T细胞受体(TCR)Vβ区域上的特异性结构域直接相连接,快速并过量激活感染者的免疫系统引起各种炎症因子以及趋化因子的大量释放并且最终导致高烧、急性肺损伤、急性呼吸困难、多器官衰竭以及致死性休克等威胁生命安全的症状。针对超抗原的治疗得到了世界范围内的关注,多种基于抗体、疫苗以及其它小分子的治疗研究已经展开。本研究采用分子克隆的方法将修改过TCR Vβ结合区的SEB基因(rSEB)与结核分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)基因融合,构建原核表达质粒pET-28a-rS-H,经表达成功获得一种新型的SEB重组疫苗rS-H。在对表达及纯化工艺进行优化后得出:通过对诱导表达条件的优化,将目的蛋白的表达量提高了约15%;通过对包涵体洗涤条件、包涵体裂解条件以及包涵体复性条件的优化将粗纯品中目的蛋白的纯度提高约40%;通过对金属螯合层析的上样流速以及Q阴离子交换层析的梯度洗脱长度进行优化,重组蛋白的纯度可以提高到90%以上,最终收率可以提高到45%以上。在对该疫苗的免疫效果进行考察中发现:经过3次皮下免疫小鼠后,通过对抗SEB特异性抗体效价结果、攻毒保护实验保护率及抗体体外中和试验结果的分析,重组蛋白rS-H成功诱导了体液免疫应答,抗SEB特异性抗体效价最高值接近215,显著高于其他疫苗对照组(P0.01);r S-H疫苗在5×LD50毒素剂量以及2×LD50毒素剂量攻毒后保护率分别达到80%(i.n.)与90%(i.p.),高于其它疫苗对照组;并且有效缓解攻毒后引起的肺部、心脏以及肾脏组织的出血情况与病变情况;在LD50与LD10剂量下分别经腹腔与滴鼻攻毒后,rS-H疫苗组可以抑制各细胞因子的升高,显著低于阴性对照组(P0.01);体外攻毒实验中,rS-H疫苗组诱导的特异性抗体可以有效中和SEB毒素并且抑制SEB引起的各炎症细胞因子升高,各细胞因子水平显著低于对照组(P0.05)。以上结果表明,本研究制备的rS-H可以有效引起体液免疫应答,成功诱导抗SEB抗体,并且在攻毒后可以有效缓解SEB引起的症状。
【关键词】：超抗原 SEB 重组蛋白 原核表达 体液免疫
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-33
• 1.1 金黄色葡萄球菌11-12
• 1.2 SEs的超抗原性质12-14
• 1.3 超抗原相关信号通路14-19
• 1.4 超抗原与细胞应答19-21
• 1.5 SEs相关肠胃疾病21-23
• 1.6 SEB作为生物战剂应用的潜能23-24
• 1.7 超抗原休克小鼠模型24-26
• 1.8 超抗原的治疗策略26-30
• 1.9 结核分枝杆菌热休克蛋白30-33
• 第2章 融合蛋白rS-H的表达及纯化33-58
• 2.1 材料、仪器及溶液配制方法33-35
• 2.1.1 材料33
• 2.1.2 仪器33-34
• 2.1.3 溶液配制34-35
• 2.2 试验方法35-47
• 2.2.1 原核表达载体pET-28a-rS-H的构建35-41
• 2.2.2 融合蛋白rS-H的表达、粗纯及相关工艺优化41-44
• 2.2.3 融合蛋白rS-H的精纯及其相关工艺优化44-47
• 2.3 实验结果47-56
• 2.3.1 重组表达质粒pET-28a-rS-H的鉴定47-49
• 2.3.2 诱导表达条件及包涵体蛋白 rS-H 粗纯工艺条件优化结果49-52
• 2.3.3 融合蛋白rS-H精纯及相关优化结果52-56
• 2.4 讨论56-58
• 第3章 融合蛋白rS-H的体液免疫效果研究58-73
• 3.1 实验材料、仪器及溶液配制58-59
• 3.1.1 材料58
• 3.1.2 仪器58-59
• 3.1.3 溶液配制59
• 3.2 方法59-63
• 3.2.1 体液免疫分组以及时间安排59-61
• 3.2.2 腹腔攻毒及滴鼻攻毒模型毒素LD50的测定61
• 3.2.3 SEB体内攻毒保护方案设计61-62
• 3.2.4 体外抗体中和试验62-63
• 3.3 结果63-71
• 3.3.1 抗SEB特异性抗体滴度测定结果63-65
• 3.3.2 腹腔攻毒试验与滴鼻攻毒实验LD50测定结果65
• 3.3.3 SEB+LPS体内攻毒保护结果65-69
• 3.3.4 体外抗体中和保护实验结果69-70
• 3.3.5 组织病理切片分析结果70-71
• 3.4 讨论71-73
• 第4章 结论73-74
• 致谢74-75
• 参考文献75-80

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本文编号：347709