铜绿假单胞菌芳香硫酸酯酶突变体库的构建与筛选

发布时间：2022-02-26 06:01

　　铜绿假单胞菌芳香硫酸酯酶（Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase,PAAS）是生化制药工具酶及潜在免疫分析标记酶,可与碱性磷酸酶配对应用于SDESA-ELISA。然而野生型PAAS催化活性低,对其进行酶分子工程改造是提高催化活性的有效策略。课题组前期建立了基于双酶融合表达测定酶突变体相对标签酶活性比值的突变体库高通量筛选方法。该方法用于PAAS突变体库筛选时,通过构建ECAP-PAAS融合表达蛋白,以大肠杆菌碱性磷酸酶（Escherichia coli alkaline phosphatase,ECAP）为标签酶,PAAS为目标酶,采用光度法单通道双酶同测（SDESA）测定PAAS/突变体与ECAP的活力比值作为筛选指标。分别以碱裂解与超声裂解对M72位突变体制备粗酶液并测定活力比值。两种裂解方法所得粗酶液活力比值无明显统计学差异,因此选取适合高通量筛选体系的碱裂解制备粗酶液。通过测定大肠杆菌细胞裂解液中ECAP的本底表达确定筛选阈值;当ECAP活力≥0.0053 kU/L时,认为双酶融合表达蛋白表达成功。双酶融合表达联合48孔板培养、碱裂解、96孔板... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
英汉缩略语名词对照
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 融合表达高通量筛选方法的评价
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
第二部分 定点饱和突变建库方案的比较
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
第三部分 获得高活性PAAS突变体的新策略
    1 PAAS保守性分析
    2 基于计算分析的半理性设计
    3 联用随机突变与迭代饱和突变获得高活性突变体
全文总结
综述
参考文献
致谢
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本文编号：3644141