阳离子抗菌肽原核及真核分泌表达体系的构建

发布时间：2017-05-14 20:27

  本文关键词：阳离子抗菌肽原核及真核分泌表达体系的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：阳离子抗菌肽是生物体内产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽物质,是进化上保守的天然免疫重要活性分子。由于抗菌肽天然来源有限,化学合成价格昂贵；而利用基因工程技术生产抗菌肽周期短、产量高、活性强；目前这种方法已成为生产抗菌肽的理想方法。阳离子抗菌肽对大肠杆菌有杀伤作用,而且自身易被宿主蛋白酶降解,因此我们在抗菌肽的N端加上含负电荷的融合头,中和抗菌肽上的正电荷,抑制其对宿主的毒性。切除融合头一直都是抗菌肽融合表达的重要步骤。酶法切割成本极高；化学切割中溴化氢有剧毒,难以大规模使用；本实验在融合头和抗菌肽之间引入Asp-Pro酸敏感位点,酸特异性切割去除融合头；便于操作,成本低廉。本实验所用的融合头是Cherry,它可能具有促进融合蛋白分泌到培养上清中的能力；但并不能保证融合蛋白全部分泌出去。而本实验在诱导过程中加入甘氨酸,它可以干扰细胞壁肽聚糖层的合成,破坏细胞外膜的完整性,导致周质空间内蛋白质包括融合蛋白的释放,进而提高分泌效率。Pleurocidin是从刺泥鲽的皮肤粘液中分离出的含25个氨基酸残基的线性多肽,具有广谱的抗菌活性,能够抑制多种革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌及真菌。Pleurocidin基因片段和Cherry DNA序列尾通过平末端连接组成融合基因,再将融合基因连接到pET22b(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。用4 g/L乳糖诱导大肠杆菌20 h,在诱导16h时加入终浓度4g/L甘氨酸,融合蛋白成功表达,几乎全部分泌到培养上清中,融合蛋白产量达到516μg/mL Pleurocidin和Cherry尾之间有Asp-Pro酸敏感位点,向培养上清液中加稀盐酸,使其终浓度为100mmol/L,在65℃水浴锅中水解72 h,得到r-Pleurocidin。Pleurocidin对大肠杆菌DH5a和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌活性。牛乳铁蛋白肽(LfcinB)是牛乳铁蛋白在酸性环境中经胃蛋白酶水解,从N-端释放的结构域,含25个氨基酸残基,具有广泛、高效的抑菌活性。本实验同时对抗菌肽在酿酒酵母中的分泌表达进行了研究,用组成型启动子TPI替换pYES2质粒中的GAL1启动子,以LfcinB为目的抗菌肽,成功构建了重组质粒pYES2-TPI-LfcinB,将其电击转化酿酒酵母INVScl,通过尿嘧啶缺陷筛选培养基(SC-U培养基)筛选阳性克隆,获得了酿酒酵母pYES2-TPI-LfcinB菌株。该菌株在培养过程中,不需诱导,LfcinB可以直接分泌表达；不存在葡萄糖抑制LfcinB表达的问题。对培养上清做抑菌实验证明：LfcinB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有明显的抑菌活性。此实验为抗菌肽在酿酒酵母中的组成型分泌表达提供了技术支持,具有一定的指导意义。
【关键词】：Pleurocidin 分泌表达 Asp-Pro酸敏感位点 牛乳铁蛋白肽 组成型表达 酿酒酵母
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R392
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词表7-11
• 第一章 引言11-23
• 1.1 抗菌肽11-17
• 1.1.1 抗菌肽的分类11-13
• 1.1.2 抗菌肽的理化性质13
• 1.1.3 抗菌肽的作用机制13-14
• 1.1.4 抗菌肽的生物活性14-16
• 1.1.5 抗菌肽的应用前景16-17
• 1.2 抗菌肽的表达研究进展17-20
• 1.2.1 抗菌肽的来源17
• 1.2.2 抗菌肽的原核表达体系17-19
• 1.2.3 抗菌肽的真核表达体系19-20
• 1.3 存在的问题20-21
• 1.4 本文的研究内容和意义21-23
• 1.4.1 本文的研究内容21
• 1.4.2 本文的研究意义21-23
• 第二章 阳离子抗菌肽Pleurocidin在大肠杆菌中的高效分泌表达23-55
• 引论23
• 2.1 材料23-28
• 2.1.1 主要仪器设备23-24
• 2.1.2 主要试剂24
• 2.1.3 菌株及载体24-25
• 2.1.4 主要溶液剂试剂配制25-28
• 2.2 方法28-40
• 2.2.1 搭桥引物PCR合成Pleurocidin基因片段28-30
• 2.2.2 Pluerocidin在大肠杆菌中的诱导表达30-35
• 2.2.3 融合蛋白Cherry-Pleurocidin在大肠杆菌中的诱导表达35-40
• 2.3 结果40-53
• 2.3.1 搭桥引物PCR扩增结果40-41
• 2.3.2 含双酶切位点的Pleurocidin基因片段PCR结果41-42
• 2.3.3 含单酶切位点的Pleurocidin和Cherry基因片段的PCR结果42-43
• 2.3.4 融合基因Cherry-Pleurocidin的PCR扩增结果43
• 2.3.5 筛选阳性克隆43-44
• 2.3.6 工程菌的诱导表达44-45
• 2.3.7 乳糖诱导组和乳糖+甘氨酸诱导组SDS-PAGE比较45-46
• 2.3.8 Lowry法测蛋白浓度46-47
• 2.3.9 乳糖诱导组和乳糖+甘氨酸诱导组的配对数据t检验47-48
• 2.3.10 融合蛋白酸特异性切割48-49
• 2.3.11 Pleurocidin的纯化结果49-50
• 2.3.12 Pleurocidin的抑菌活性鉴定50-51
• 2.3.13 Pleurocidin的质谱分析51-53
• 2.4 讨论53-55
• 第三章 pYES2质粒启动子改造及其在酿酒酵母异源基因表达中的应用55-69
• 引论55-56
• 3.1 材料56-57
• 3.1.1 主要仪器设备56
• 3.1.2 菌株和载体56
• 3.1.3 主要试剂56
• 3.1.4 常用试剂配制方法56-57
• 3.2 方法57-61
• 3.2.1 引物的设计与合成57
• 3.2.2 TPI启动子和质粒pYES2-α-LfcinB的PCR反应57
• 3.2.3 TPI启动子和质粒pYES2-α-LfcinB的磷酸化与平末端连接57-58
• 3.2.4 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞58
• 3.2.5 筛选阳性克隆58
• 3.2.6 提取重组质粒pYES2-TPI-LfcinB58-59
• 3.2.7 酿酒酵母INVScl感受态细胞的制备59
• 3.2.8 重组质粒pYES2-TPI-LfcinB转化酿酒酵母INVSc159-60
• 3.2.9 筛选酿酒酵母阳性克隆60
• 3.2.10 酿酒酵母pYES2-TPI-LfcinB的培养60
• 3.2.11 酿酒酵母pYES2-TPI-LfcinB培养上清抑菌活性的检测60-61
• 3.3 结果61-67
• 3.3.1 TPI启动子的PCR扩增结果61-62
• 3.3.2 pYES2质粒的PCR结果62-63
• 3.3.3 pYES2-TPI-LfcinB菌株的OD600检测结果63-64
• 3.3.4 培养时间对Lfcin B的表达活性的影响64-65
• 3.3.5 不同体积培养上清SDS-PAGE检测结果65-66
• 3.3.6 LfcinB的抑菌活性研究66-67
• 3.4 讨论67-69
• 第四章 总结69-70
• 参考文献70-77
• 致谢77-78
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文78

【参考文献】

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本文编号：366201