细粒棘球蚴微管蛋白的原核表达、体外聚合及药物作用研究

发布时间：2023-10-06 14:03

　　目的:通过克隆表达细粒棘球蚴微管蛋白,并进行药物相关作用研究,寻找在细粒棘球蚴的生命过程起重要作用、并可作为药物靶点的微管蛋白同型。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)对细粒棘球蚴微管蛋白同型的表达水平进行分析;采用原核表达系统及镍柱亲和层析法表达、纯化细粒棘球蚴微管蛋白 Tubulin-β4(EgTUB4)和 Tubulin-α9(EgTUA9)两个同型,并利用 SDS-PAGE进行鉴定;用浊度法检测微管蛋白溶液吸光值的变化以分析重组微管蛋白rEgTUB4和rEgTUA9的聚合效果并用透射电镜观察聚合产物的超微结构;将苯并咪唑类药物同重组微管蛋白共孵育,观察其对微管蛋白聚合反应的影响,同时用RT-PCR和Western blot法评价上述药物对细粒棘球蚴微管蛋白同型基因转录和蛋白表达的影响。结果:细粒棘球蚴的多种微管蛋白同型的表达水平各不相同,其中Tubulin-α5、Tubulin-α9、Tubulin-β2(EgTUB2)、Tubulin-β4(EgTUB4)和 Tubulin-β6(EgTUB6)等5个同型在原头节和囊壁组织中的表达水平均较高。原核表达得到rEgTUB4...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
常用缩写词中英文对照表
前言
    1 棘球蚴病的流行现状
        1.1 细粒棘球蚴病
        1.2 多房棘球蚴病
        1.3 其他棘球蚴病
    2 棘球蚴病的治疗措施
    3 棘球蚴病治疗药物的研究手段概述
    4 微管和微管蛋白
        4.1 微管的结构特点
        4.2 微管的动力学特征及生物学功能
        4.3 寄生虫微管的研究现状
        4.4 微管蛋白体外聚合反应的研究现状
        4.5 微管蛋白抑制剂
    5 苯并咪唑类药物的抗寄生虫作用
    6 研究目的和意义
    7 研究目标与内容
        7.1 研究目标
        7.2 研究内容
第一部分 细粒棘球蚴微管蛋白的表达水平分析
    引言
    1 材料与试剂
        1.1 细粒棘球蚴原头节和囊壁组织
        1.2 主要仪器与设备
        1.3 主要试剂与试剂盒
    2 方法与步骤
        2.1 基因组的搜索与引物设计
        2.2 总RNA的提取
        2.3 cDNA的合成
        2.4 细粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β同型基因的表达分析
    3 结果与分析
        3.1 总RNA的质量鉴定
        3.2 细粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β基因mRNA的表达量
            3.2.1 细粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β的扩增曲线及熔解曲线
            3.2.2 细粒棘球蚴各同型微管蛋白的相对表达量
    4 讨论
第二部分 细粒棘球蚴微管蛋白的原核表达及纯化
    引言
    1 材料与试剂
        1.1 原头节cDNA
        1.2 主要仪器与设备
        1.3 主要试剂与试剂盒
    2 方法与步骤
        2.1 引物设计与合成
        2.2 原核表达载体的构建
            2.2.1 目标基因的扩增
            2.2.2 琼脂糖凝胶电泳及切胶
            2.2.3 目标片段的胶回收
            2.2.4 TA-克隆
            2.2.5 感受态细胞的转化
            2.2.6 质粒抽提
            2.2.7 酶切及酶连
        2.3 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析
        2.4 重组蛋白表达条件的优化
        2.5 重组蛋白的大量表达及可溶性蛋白的纯化
        2.6 重组蛋白的Western Blot验证
    3 结果与分析
        3.1 目标基因的扩增
        3.2 菌落PCR验证
        3.3 双酶切鉴定
        3.4 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析
        3.5 重组蛋白表达条件的优化
        3.6 重组蛋白的纯化
        3.7 重组蛋白的特异性鉴定
    4 讨论
第三部分 细粒棘球蚴重组微管蛋白的体外聚合及苯并咪唑类药物的影响
    引言
    1 材料与试剂
        1.1 原头节
        1.2 主要仪器与设备
        1.3 主要试剂与试剂盒
    2 方法与步骤
        2.1 重组微管蛋白的体外聚合
            2.1.1 聚合产物的激光共聚焦观察
            2.1.2 聚合产物的透射电镜观察
        2.2 苯并咪唑类药物对重组微管蛋白体外聚合的影响
        2.3 苯并咪唑类药物对猪脑微管蛋白体外聚合的影响
        2.4 苯并咪唑类药物对原头节基因转录及蛋白表达的影响
    3 结果与分析
        3.1 重组微管蛋白体外聚合浓度的优化
            3.1.1 聚合产物的激光共聚焦观察
            3.1.2 聚合产物的透射电镜观察
        3.2 苯并咪唑类药物对重组微管蛋白体外聚合的影响
        3.3 苯并咪唑类药物对猪脑微管蛋白体外聚合的影响
        3.4 苯并咪唑类药物对原头节微管蛋白基因mRNA表达量的影响
        3.5 苯并咪唑类药物对原头节微管蛋白基因蛋白表达的影响
    4 讨论
结论和展望
参考文献
综述
    参考文献
论著
发表文章
致谢



本文编号：3851842