表达肠道病毒71型中和表位融合基因的重组耻垢分枝杆菌的构建及其免疫原性初步评价

发布时间：2024-02-20 20:00

　　目的构建表达嵌合肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中和表位VP1-SP70(E1)和VP2-141(E2)融合蛋白HBc-E1/2的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS),并评价其在小鼠体内的免疫原性。方法 PCR法扩增目的基因HBc-E1/2,并克隆至E.coli-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV261-HBc-E1/2,电转化至mc2 155(MS野生株ATCC 607的突变体),获得重组菌pMV261-HBc-E1/2/mc2 155,将其经腹腔免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pMV261-HBc-E1/2构建正确。重组菌pMV261-HBc-E1/2/mc2 155表达产物可与E1多肽、E2多肽及EV71灭活疫苗小鼠免疫血清发生特异性结合,且在相对分子质量约27 500和55 000处可见特异性蛋白结合条带。免疫小鼠血清抗E1及E2表位抗体效价均为1∶1 600。结论成功构建了呈递HBc-E1/2的重组MS,可诱导小鼠产生EV71的特异性抗体。本实...

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【部分图文】：

图1HBc-E1/2基因PCR产物电泳图

HBc-E1/2基因PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见650bp的目的条带，大小与预期一致，见图1。2.2重组质粒的鉴定

图2重组菌的菌落PCR鉴定

还原及非还原型SDS-PAGE均可见相对分子质量约27500目的蛋白条带，但后者还出现相对分子质量约55000的二聚体蛋白条带，见图4。表明二硫键可能负责嵌合HBc二聚体的形成，证实HBc-E1/2在MS中表达成功。图3重组质粒pMV261-HBc-E1/2的双酶切（Pst....

图3重组质粒pMV261-HBc-E1/2的双酶切（PstⅠ/HindⅢ）鉴定

图2重组菌的菌落PCR鉴定图4重组MS表达产物的还原型（A）及非还原型（B)SDS-PAGE分析

图4重组MS表达产物的还原型（A）及非还原型（B)SDS-PAGE分析

图3重组质粒pMV261-HBc-E1/2的双酶切（PstⅠ/HindⅢ）鉴定2.3.2Westernblot检测

本文编号：3904463