β1整合素的表达纯化及在筛查幽门螺杆菌与之结合蛋白中的应用

发布时间：2017-05-30 05:08

  本文关键词：β1整合素的表达纯化及在筛查幽门螺杆菌与之结合蛋白中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)近年来被认为是一种兼性胞内菌,它不仅能侵入细胞,而且可在细胞内繁殖和产生毒素。已有研究证实,Hp可通过细胞表面的β1整合素介导而侵入胃上皮细胞,但与此相关的细菌蛋白及其相应作用目前尚不清楚。本课题旨在通过原核表达纯化技术,获得可溶性的β1整合素蛋白。将制备好的β1整合素蛋白和本实验室已构建好的Hp T7噬菌体展示c DNA文库亲和淘洗筛选,获得与β1整合素相互作用的Hp蛋白DNA序列,为下一步研究和β1整合素相互作用的蛋白以及相关功能奠定基础。方法①从GENBANK获得β1整合素CDS区序列,保留β1整合素的胞外膜区,截掉β1整合素的N端信号肽序列。②分析β1整合素的稀有密码子分布情况,优化β1整合素的稀有密码子。参照β1整合素的m RNA二级结构,优化TIR的密码子。③全基因合成β1整合素序列并插入到克隆载体p UC18。分别将p UC18-β1-integrin质粒和p ET30a载体双酶切,回收后的片段使用T4连接酶连接。④p ET30a-β1-integrin质粒转化BL21(DE3)感受态,挑取阳性单克隆诱导表达并SDS-PAGE电泳分析其表达情况。⑤取保存的菌株诱导后超声破菌收集上清,SDS-PAGE电泳分析蛋白的可溶性。⑥诱导细菌表达并收集包涵体,包涵体破碎和溶解后过Ni-NTA柱,用含不同浓度的咪唑洗脱液洗脱,收集各个浓度的洗脱液并SDS-PAGE电泳分析。⑦将溶解的蛋白装入透析袋,先以复性液透析三次,再以蛋白贮存液透析三次,滤膜过滤后于冰箱冻存。⑧使用纯化的β1整合素筛查Hp T7噬菌体展示c DNA文库。挑取单个噬菌斑进行PCR反应,琼脂糖电泳检查PCR反应产物并回收,T7特异性引物进行测序分析。⑨将获得的序列在NCBI(美国国立生物技术信息中心)Gen Bank数据库中进行同源序列比较。结果①全基因合成的p UC18-β1-integrin质粒单酶切鉴定结果正确。②构建好的p ET30a-β1-integrin质粒测序结果正确。③p ET30a-β1-integrin质粒转化BL21(DE3)后挑取单克隆诱导表达,SDS-PAGE结果得出在β1整合素分子量80k D附近有条带。④SDS-PAGE分析蛋白可溶性得出,β1整合素在上清表达量很低,大部分以包涵体形式表达。⑤通过包涵体变性和复性得到可溶的β1整合素蛋白,其浓度为0.32mg/ml。Western blot使用his-tag抗体检测目的蛋白,在其分子量80k D附近有条带。SDS-PAGE检测纯化好的蛋白,在其分子量80k D附近有单一条带。蛋白冻融实验得出目的蛋白冻融后无悬浮物,离心后无明显沉淀。⑥Hp T7噬菌体展示c DNA文库筛选与β1整合素互相结合的蛋白,测序比对后得到2个与β1整合素结合的预选蛋白。结论①通过原核表达、纯化技术,获得可溶性、纯度较高的β1整合素蛋白。②Hp T7噬菌体展示c DNA文库筛选与β1整合素互相结合的蛋白,得到2个和β1整合素结合的预选蛋白。
【关键词】：幽门螺杆菌 β1整合素 原核表达 纯化 亲和淘洗筛选
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 英文缩略语表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-13
• 材料和方法13-25
• 结果25-34
• 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-41
• 综述41-48
• 参考文献44-48
• 致谢48

【参考文献】

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本文编号：406431