肺炎链球菌DnaJ调节树突状细胞诱导T细胞免疫应答的分子机制研究

发布时间：2017-06-02 00:06

  本文关键词：肺炎链球菌DnaJ调节树突状细胞诱导T细胞免疫应答的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是一种革兰阳性的条件致病菌,能够引起脑膜炎、败血症和社区获得性肺炎等多种侵袭性疾病。耐药菌的广泛出现使得疫苗预防成为控制S.pn感染的有效策略。肺炎链球菌DnaJ是一种与S.pn毒力相关的热休克蛋白(heat shock protein, Hsp),属于Hsp40家族,作为疫苗经鼻腔或腹腔免疫小鼠,能够诱导小鼠产生S.pn感染的保护性免疫应答,但是其具体免疫应答机制不清。研究DnaJ诱导宿主免疫应答的机制有助于Spn疫苗的研发。树突状细胞(dendritic cell, DC)是已知的最有效的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC),在抗病原体的固有免疫和适应性免疫中都发挥重要作用。在其他细菌中发现多种热休克蛋白可以活化DC。最近在S.pn中也发现,Hsp100/C1pP可以被Toll-样受体4(Toll-like reseptor 4, TLR4)识别,通过活化MAPK和NF-κB信号通路诱导DC活化和成熟,从而启动Thl免疫应答。然而,作为一种热休克蛋白,肺炎链球菌DnaJ能否诱导DC的成熟、介导DC成熟的分子机制,以及对T细胞的极化情况还未见报道。在本研究中,我们旨在研究肺炎链球菌DnaJ介导DC成熟的效能及其诱导T细胞免疫应答的机制。方法1.利用大肠杆菌原核表达DnaJ重组蛋白(recombinant DnaJ, rDnaJ)纯化并去除LPS。2.研究rDnaJ蛋白诱导DC活化的机制(1) rDnaJ蛋白作用于小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测BMDC上MHCⅡ、CD86、CD40的表达；ELISA检测细胞因子TNF-α IL-6和IL-12p40的分泌情况。(2) rDnaJ蛋白刺激TLR2 KO、TLR4 KO小鼠和WT小鼠来源的BMDC后,FCM检测MHCⅡ、CD86、CD40的表达；ELISA检测细胞因子TNF-α和IL-6的分泌情况。(3) 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)和磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)抑制剂抑制剂预处理BMDC后,ELISA检测rDnaJ其对TNF-α和IL-6分泌的影响；Western blot检测MAPK、NF-kB和Akt的磷酸化水平。3.研究rDnaJ蛋白诱导T细胞的免疫应答机制(1) 体外实验检测rDnaJ蛋白活化的BMDC在促进T细胞分化中的作用。rDnaJ蛋白刺激后的DC与CD4+T细胞共培养36h,ELISA检测培养上清IFN-γ、IL-4口IL-17A的表达；FCM分别检测IFN-γ+CD4+、IL-4+CD4+和IL-17A+CD4+细胞的百分比。(2) 过继转移实验检测rDnaJ蛋白活化的BMDC在促进T细胞分化中的作用。分别在第0、14和28d,将rDnaJ蛋白刺激后的BMDC经腹腔过继转移到WT小鼠体内。取小鼠脾细胞,在体外经rDnaJ蛋白再次刺激36h后,ELISA检测脾细胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。(3) 体内实验检测TLR2和TLR4在诱导T细胞应答中的作用将WT、TLR2 KO小鼠和TLR4 KO小鼠各分为3组：CT+rDnaJ蛋白组、CT组和PBS组。在第0、7和14d免疫小鼠后,用rDnaJ蛋白刺激免疫小鼠脾细胞3d后,ELISA检测IFN-γ、 IL-4和IL-17A水平。结果1.成功构建了原核表达质粒pET-28a(+)-deal,诱导表达后获得了高纯度的rDnaJ蛋白；并且采用PmB-agarose去除蛋白溶液中的LPS,使LPS残留量不影响后续实验。2.成功培养了小鼠BMDC,其纯度达80%以上。3. rDnaJ蛋白能够诱导小鼠BMDC成熟,促使BMDC高表达细胞表面分子(MHCII、CD86和CD40)以及分泌细胞因子TNF-α IL-6和IL-12p40。4. rDnaJ蛋白通过TLR4受体诱导小鼠BMDC成熟,与TLR2无关。5. rDnaJ蛋白通过p38、ERK、JNK、PI3K-Akt和NF-κB等信号通路诱导小鼠BMDC成熟。6. rDnaJ蛋白通过TLR4刺激成熟的小鼠BMDC使初始CD4-T细胞向Th1和Th17细胞极化,诱导宿主产生Thl和Th17型免疫应答。结论本研究表明rDnaJ蛋白能够诱导强烈的BMDC免疫应答,该免疫应答是通过TLR4受体而不是TLR2受体、在MAPK、PI3K-Akt和NF-κB多条信号通路的参与下完成的。成熟BMDC可以使初始T细胞向Thl和Th17极化,引起宿主产生Thl和Th17型免疫应答。本研究初步阐明了肺炎链球菌DnaJ蛋白引起宿主免疫应答的机制,为肺炎链球菌DnaJ蛋白作为蛋白疫苗的研发奠定了基础。
【关键词】：肺炎链球菌 DnaJ 树突状细胞 T细胞应答
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 第一部分 肺炎链球菌rDnaJ蛋白的表达和纯化18-25
• 1 实验材料18-20
• 2 实验方法20-22
• 3 实验结果22-24
• 4 讨论24-25
• 第二部分 肺炎链球菌DnaJ诱导BMDC免疫应答的机制25-35
• 1 实验材料25-26
• 2 实验方法26-28
• 3 实验结果28-33
• 4 讨论33-35
• 第三部分 DnaJ蛋白在诱导T细胞免疫应答中的作用35-42
• 1 实验材料35
• 2 实验方法35-37
• 3 实验结果37-41
• 4 讨论41-42
• 全文总结42-43
• 参考文献43-46
• 文献综述46-53
• 参考文献49-53
• 致谢53-54
• 攻读学位期间发表的学术论文题录54

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 CQS;美国耐多药肺炎链球菌的发生率提高[J];中华医学信息导报;2001年06期

2 邬硕平,杨美云,蒋泓宇;警惕肺炎链球菌引起的老年脑膜炎[J];上海医学检验杂志;2002年03期

3 张雪梅;肺炎链球菌自然转化机制的研究进展[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2002年06期

4 宋琳,瞿介明;肺炎链球菌对大环内酯类抗生素耐药的研究进展[J];中国呼吸与危重监护杂志;2003年05期

5 彭燕,徐永涛;菌落形态发生变异的肺炎链球菌的鉴定[J];临床检验杂志;2004年02期

6 周忠华,刘华,喻华;69株肺炎链球菌的体外抗菌药物活性研究[J];江西医学检验;2004年03期

7 徐礼锋;郑雪辉;祝进;陈芳建;陆军;;52株肺炎链球菌耐药性分析[J];江西医学检验;2006年01期

8 孙端阳;施金玲;蔡璇;;126株肺炎链球菌临床菌株的耐药率分析[J];检验医学;2006年02期

9 黄晓群;庞栋;;肺炎链球菌的检验技术及其进展[J];医学文选;2006年04期

10 邱付兰;钟荣荣;;77例肺炎链球菌的分布及药敏分析[J];江西医学检验;2007年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 周忠华;刘华;喻华;;69株肺炎链球菌的体外抗菌药物活性研究[A];中华医院管理学会第十一届全国医院感染管理学术年会论文汇编[C];2004年

2 唐恒;陈勃江;李为民;;219株呼吸道肺炎链球菌的分离及耐药性分析[A];中华医学会第12次全国内科学术会议论文汇编[C];2009年

3 张媛媛;王一雯;孙胜利;贺建平;;耐青霉素性肺炎链球菌致急性化脓性脑膜炎1例[A];第九届西北五省（区）检验医学学术会议论文汇编[C];2005年

4 胡惠丽;胡翼云;何乐健;沈叙庄;高薇;杨永弘;;肺炎链球菌在儿童社区获得性肺炎死亡病例中致病地位的研究[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

5 胡庆丰;吕火祥;沃铭毅;;53例呼吸道分离的肺炎链球菌耐药性分析[A];2007年浙江省医学检验学学术年会论文汇编[C];2007年

6 吴佳学;季海生;朱德全;;儿科痰培养肺炎链球菌耐药分析对临床的指导作用[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

7 高薇;姚开虎;俞桑洁;杨永弘;;2000～2005年分离自北京儿童鼻咽部的19群肺炎链球菌的耐药性变化[A];中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会论文汇编（上册）[C];2008年

8 余素飞;厉世笑;傅鹰;陈慧红;朱海燕;陈文娴;张慧娜;;肺炎链球菌对大环内酯类的耐药机制研究[A];2011年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2011年

9 黄小翠;崔亚利;;儿童使用的肺炎链球菌疫苗研究进展[A];第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会论文汇编[C];2014年

10 黄勇;万根平;顾晓琼;邓秋连;梁柳;钟华敏;;广州地区儿童感染肺炎链球菌耐药相关基因的研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 北京儿童医院微生物免疫室 姚开虎;接种哪种肺炎链球菌疫苗好[N];健康报;2007年

2 邓力;肺炎链球菌易攻击小孩和老人[N];健康报;2007年

3 记者 王丹;儿童肺炎链球菌性疾病防治指南发布[N];健康报;2010年

4 周密;山羊可能感染了肺炎链球菌病[N];江苏农业科技报;2010年

5 记者 吴伟农;美科学家绘制出肺炎链球菌基因图谱[N];新华每日电讯;2001年

6 本报记者 李颖;肺炎链球菌遇流感病毒危害更大[N];科技日报;2010年

7 卫生部北京医院 张秀珍;肺炎链球菌对青霉素耐药率上升快[N];健康报;2008年

8 中华医学会公共卫生学分会主任委员 曾光;秋冬季请呵护好“呼吸大道”[N];健康报;2010年

9 北京儿童医院呼吸科 刘金荣邋姚开虎 赵顺英;小儿肺炎为何难愈[N];健康报;2007年

10 记者 毛黎;遨游天宇的特殊客[N];科技日报;2007年

  本文关键词：肺炎链球菌DnaJ调节树突状细胞诱导T细胞免疫应答的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：413773