封闭N-cadherin解整合素金属蛋白酶水解位点的单链抗体的制备及鉴定

发布时间：2017-06-25 20:25

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【摘要】：目的制备封闭神经型钙黏素(N-cadherin)解整合素金属蛋白酶水解位点(ADAM)的单链抗体(scFv),并进行鉴定。方法首先利用RT-PCR技术从分泌抗N-cadherin的ADAM水解位点单克隆抗体(mAb)细胞株中扩增出重链(V_H)和轻链(V_L)可变区基因片段,然后通过重叠延伸PCR法(SOE-PCR),构建成scFv基因片段。再将其克隆入原核表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达,通过镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot法等测定重组蛋白的生物学活性。结果PER、酶切和测序表明scFv片段长744 bp,编码248个氨基酸。scFv基因表达载体转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达出相对分子质量(M_r)约29 000的目的蛋白,主要为包涵体形式,经变性,纯化和复性后,获得纯度达90%以上的scFv蛋白,ELISA和Western blot法检测表明可溶性scFv可以与N-cadherin的ADAM水解位点序列多抗原短肽和全长N-cadherin结合。结论成功构建并表达封闭N-cadherin的ADAM加工位点单链抗体。
【作者单位】： 武汉大学人民医院儿科;武汉市医学科学研究所;
【关键词】： ADAM N-cadherin 单链抗体 基因表达
【基金】：国家自然科学基金(81000094) 武汉大学自主青年基金(4101016)
【分类号】：R392.11
【正文快照】： 神经型钙黏素(neural cadherin,N-cadherin)是调节细胞与细胞之间,细胞与基质之间黏附反应的重要媒介,对维持组织结构形态起重要作用[l_21。N-cadherin与连环蛋白(catenins)形成N型钙黏蛋白/ 连环蛋白复合体(以下简称钙-连复合体),可使N- cadherin集中定位于细胞与细胞间的接

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