体内获得性耐药进程中白念珠菌表型和基因表达变化的研究

发布时间：2017-06-29 15:12

  本文关键词：体内获得性耐药进程中白念珠菌表型和基因表达变化的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一章体内获得性耐药进程中白念珠菌表型变化的研究目的初步探索白念珠菌在体内获得性耐药进程中出现的表型改变。方法选用6株同一来源的在体内氟康唑长期作用下耐药性逐渐增强的一组白念珠菌(编号分别为Ca1、2、5、8、14、17,其中Ca1为用药前),进行形态学研究、菌丝形成实验、表面疏水性(CSH)实验以及絮凝实验,探索白念珠菌在体内获得性耐药这一过程中形态结构、菌丝形成能力、黏附性的变化。结果实验菌株的形态和超微结构以及细胞间的黏附能力未见明显改变。除Ca17外,Ca2、5、8、14的菌丝形成率和CSH值都明显比用药前的敏感株Ca1高。结论实验菌株的菌丝形成能力、与宿主或非生命基质间的黏附能力在获得性耐药的过程中发生了相应的变化,这种改变的确切机制和意义尚有待进一步研究。第二章体内获得性耐药进程中白念珠菌生物膜形成能力及其药物敏感性变化的研究第一节 体内获得性耐药进程中白念珠菌生物膜形成能力的研究目的对实验菌株进行生物膜构建及结构观察,并比较在体内获得性耐药进程中各菌株生物膜形成能力的差异。方法用24孔组织培养板构建第一章所用6株菌的生物膜,在不同的培养时间(2、4、8、12、24h)置于倒置显微镜下对生物膜的形成过程进行观察；生物膜成熟后,用共聚焦激光扫描显微镜观察比较各菌株生物膜形成情况；用甲基四氮盐(XTT)减低法评价生物膜生长过程中活力的变化。结果实验菌株的生物膜形成能力存在差异,根据生物膜形成能力的不同,可将实验菌株分为：形成能力弱(用药前的敏感株和用药后耐药程度最高的菌株)和形成能力强(两者之间的4株菌,可理解为敏感和高度稳定耐药之间的过渡状态)两组。结论在获得性耐药这一进程中菌株的生物膜形成能力会发生改变,这种变化可能在对抗药物选择性压力中扮演重要角色。第二节体内获得性耐药进程中白念珠菌药物敏感性变化的研究目的比较在体内获得性耐药进程中,悬浮状态菌与生物膜状态菌对抗真菌药物敏感性的差异。方法参照CLSI-M27-A3法推荐的酵母菌微量液基稀释法对浮游状态菌株进行常用抗真菌药(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬净和两性霉素B)药物敏感性的测定；在96孔组织培养板中构建白念珠菌生物膜的体外模型,参照Pierce的生物膜药物敏感性试验方法对其进行药物敏感性测定。结果实验菌株在浮游状态对卡泊芬净和两性霉素B均维持敏感,对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的MIC值呈梯度性增高,其中Ca17对三种唑类药物均耐药。所有实验菌株在形成生物膜后,对氟康唑呈高度耐药,对伊曲康唑和伏立康唑的耐药性也显著增加,两性霉素B可在较高浓度抑制白念珠菌生物膜,卡泊芬净对白念珠菌生物膜仍维持敏感。结论在获得性耐药形成过程中,白念珠菌的药物敏感性逐渐下降。与游离状态相比,生物膜对药物的抵抗性更强。唑类药物耐药程度增加最明显；两性霉素B在较高浓度可抑制白念珠菌生物膜,但其副作用大,临床应用受限；卡泊芬净对白念珠菌生物膜的杀伤作用较强,可作为临床抗白念珠菌生物膜感染的一线药物。第三章体内获得性耐药进程中实验菌株转录组测序和分析目的研究白念珠菌在体内获得性耐药进程中基因的表达变化。方法对第一章所用6株株进行转录组测序(RNA-seq),比较亲本和MIC值最高的菌株之间的基因.表达差异以及随MIC逐渐升高有显著改变的基因；进行相关基因的功能注释及生物学通路分析等研究。结果Ca17与Cal相比,共有55条基因表达差异明显,其中有49条基因表达明显上调,6条基因表达明显下调。上调幅度最大的是MDR1,其次是CDR1、CDR2等。首次发现在用药前后出现明显改变的基因有HWP1、GLX3、GEF2、 HSL1、MEWD9、OYE32、RPS19A、HST6、NAD4、NAD5、NAD4L、PGA31、GST3等。表达上调的差异基因多与耐药和氧化应激相关。随MIC逐渐升高有相关关系改变的基因共有655条,其中显著改变的有303条,差异基因主要富集在与代谢有关的功能和生物通路上。结论白念珠菌获得性耐药的最终形成是多个基因在不同时段通过不同的机制共同作用的结果；药物外排泵表达的增加对最终高度耐药性的形成起到重要作用；药物诱导可导致菌株的代谢途径和代谢物发生变化,而改变原有的代谢过程可能是病原体产生耐药性的机制之一。
【关键词】：白念珠菌 获得性耐药 表型 生物膜 转录组测序
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R379.4
【目录】：

• 中文摘要11-13
• 英文摘要13-16
• 前言16-18
• 参考文献17-18
• 第一章 体内获得性耐药进程中白念珠菌表型变化的研究18-28
• 1. 实验材料18-20
• 1.1. 实验菌株18
• 1.2. 主要试剂及培养基配方18-20
• 1.3. 主要仪器20
• 2. 实验方法20-22
• 2.1. 菌落形态以及光学显微镜镜下结构20-21
• 2.2. 透射电镜观察菌株超微结构21
• 2.3. 观察实验菌株的菌丝形成能力21
• 2.4. 表面疏水性(CSH)实验21-22
• 2.5. 絮凝实验22
• 3. 实验结果22-25
• 3.1. 观察菌落形态以及光学显微镜镜下结构22-23
• 3.2. 透射电镜观察菌株超微结构23
• 3.3. 比较实验菌株间的菌丝形成能力的差异23-24
• 3.4. 表面疏水性(CSH)实验24-25
• 3.5. 絮凝实验25
• 4. 讨论25-27
• 参考文献27-28
• 第二章 体内获得性耐药进程中白念珠菌生物膜形成能力及其药物敏感性变化的研究28-43
• 第一节 体内获得性耐药进程中白念珠菌生物膜形成能力的研究28-36
• 1. 实验材料与仪器设备28-29
• 1.1. 实验菌株28
• 1.2. 主要试剂及培养基配方28-29
• 1.3. 主要仪器29
• 2. 实验方法29-30
• 2.1. 白念珠菌生物膜制备29
• 2.2. 倒置显微镜观察比较各菌株生物膜生长情况29-30
• 2.3. 共聚焦激光扫描显微镜下生物膜结构观察30
• 2.4. 白念珠菌生物膜活力测定30
• 3. 实验结果30-34
• 3.1. 成熟白念珠菌生物膜外观形态30
• 3.2. 倒置显微镜生物膜结构观察30-32
• 3.3. 共聚焦激光扫描显微镜生物膜结构观察32-33
• 3.4. 白念珠菌生物膜活力测定33-34
• 4. 讨论34-35
• 参考文献35-36
• 第二节 体内获得性耐药进程中白念珠菌药物敏感性变化的研究36-43
• 1. 实验材料36
• 1.1. 实验菌株36
• 1.2. 主要试剂及培养基配方36
• 1.3. 主要仪器36
• 2. 实验方法36-39
• 2.1. 生物膜形成用菌悬液制备37
• 2.2. 96孔组织培养板生物膜制备37
• 2.3. 白念珠菌药物敏感性测定37-39
• 3. 实验结果39-40
• 3.1. 悬浮状态白念珠菌药物敏感性测定结果39
• 3.2. 生物膜状态白念珠菌药物敏感性测定结果39-40
• 3.3. 实验菌株对受试药物敏感性判读40
• 4. 讨论40-42
• 参考文献42-43
• 第三章 实验菌株转录组测序和分析43-56
• 1. 实验材料43-44
• 1.1. 实验菌株43
• 1.2. 试剂与仪器43-44
• 2. 实验方法44-45
• 2.1. RNA提取44
• 2.2. 文库构建44
• 2.3. 簇生成(TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS)44
• 2.4. 上机测序(TruSeq SBS Kit v3-HS)44
• 2.5. 数据分析44-45
• 3. 实验结果45-50
• 3.1. 过滤后的数据量45-46
• 3.2. 测序数据与参照基因组比对46
• 3.3. 用药前敏感株和用药后高度耐药株基因表达的差异46-47
• 3.4. 相关性分析47-49
• 3.5. 差异基因的GO功能富集分析49
• 3.6. 差异基因的生物学通路分析49-50
• 4. 讨论50-54
• 参考文献54-56
• 全文小结56-58
• 综述58-64
• 参考文献62-64
• 在读期间发表文章64-65
• 在读期间参与会议65
• 在读期间参加培训65-66
• 致谢66-68

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