永生化人脐带间充质干细胞对常见病毒的易感性研究

发布时间：2017-07-01 10:11

  本文关键词：永生化人脐带间充质干细胞对常见病毒的易感性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)比骨髓来源的MSCs具有更强的扩增能力、免疫原性低,具有多向分化潜能、安全性好。因此MSCs在再生医学、基因治疗、细胞治疗、疫苗生产检定等方面具有广泛的临床应用前景。本课题组前期将人端粒酶催化亚基导入人脐带间充质干细胞(hMSCs),建立了永生化hMSCs,该细胞系具有体外定向分化的潜能、保持二倍体核型、表面标记符合MSCs特征且在小鼠体内无致瘤性。在此基础上,本研究检测该细胞系对痘苗病毒天坛株(VTT)、人巨细胞病毒(HCMV)、肠道病毒71型(EV71)、重组仙台病毒(rSeV-HIVgag)、重组腺病毒(rAd5-GFP、r Ad5F35-GFP)及流感病毒A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)共6大类10个病毒株的易感性,为该细胞系的进一步应用奠定基础。在实验中,使用不同剂量的病毒感染hMSCs,同时用病毒的易感细胞作为阳性对照,通过显微镜观察病毒致细胞病变效应(CPE)或报告基因表达的绿色荧光蛋白以及间接免疫荧光法检测病毒抗原的表达,判断病毒是否感染hMSCs;在此基础上,测定病毒可感染细胞的最低病毒量;通过结晶紫蚀斑法、实时荧光定量PCR法等来检测和比较感染细胞释放的病毒量。结果显示:VTT和HCMV感染的hMSCs出现明显的CPE;rAd5-GFP和rAd5F35-GFP感染的hMSCs可观察到绿色荧光;间接免疫荧光实验检测到VTT、HCMV、r SeV-HIVgag、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)和A/Brisbane/10/2007(H3N2)感染的hMSCs出现明显的绿色荧光,而EV71、A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)感染的hMSCs无可见的绿色荧光,说明hMSCs对前7个病毒易感,对后3个病毒不易感。最低感染复数结果显示:VTT、HCMV、rSeV-HIVgag、r Ad5-GFP、rAd5F35-GFP、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)可感染hMSCs的最低MOI分别为1.5×10-5、0.01、5×10-5、150、2、1、5×10-4,而感染其阳性对照细胞的最低MOI分别为1.5×10-5、2×10-4、5×10-5、5×10-5、2×10-5、0.01、5×10-4。说明hMSCs对不同种类的病毒株易感性差别很大,但其最低感染剂量普遍高于阳性对照细胞的。对病毒感染后细胞释放的子代病毒进行检测时,发现等量VTT感染后48 h、72 h,测得hMSCs上清中VTT滴度为7.13×103、2.30×105 PFU/m L,而对照细胞上清滴度为3.5×105、2.7×106 PFU/mL;等量HCMV感染后4-8 d,测得hMSCs上清HCMV DNA拷贝数分别为:3.919、4.240、4.408、4.774、4.730 lgCopies/mL,对照细胞的上清拷贝数分别为4.062、4.069、4.548、6.017、6.904 lgCopies/m L;等量B/Florida/4/2006(B/Yamagata系)感染后1~3 d,测得hMSCs上清中病毒HA分别为0、1:2、1:2,而对照细胞的上清HA均为1:256。综上所述,本研究初步研究了永生化hMSCs对常见6大类病毒中10个病毒株的易感性,并进一步分析比较了可感染的最低病毒量和病毒释放量,为其在疫苗生产检定、基因治疗、细胞治疗等方面的应用提供了实验依据。
【关键词】：永生化人脐带间充质干细胞 病毒感染 易感性
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 主要英文缩写词8-12
• 第1章 绪论12-20
• 1.1 研究背景12-17
• 1.1.1 永生化人脐带间充质干细胞12-13
• 1.1.2 常见病毒的概况13-15
• 1.1.3 hMSCs对病毒易感性的研究进展15-17
• 1.2 本文主要研究内容及意义17-18
• 1.3 课题研究技术路线18-20
• 第2章 hMSCs对VTT的易感性20-28
• 2.1 实验材料20-21
• 2.1.1 病毒和细胞20
• 2.1.2 主要试剂20
• 2.1.3 主要仪器设备20-21
• 2.1.4 实验试剂的配制21
• 2.2 实验方法21-23
• 2.2.1 Vero细胞的复苏21
• 2.2.2 Vero细胞的传代21-22
• 2.2.3 VTT的扩增22
• 2.2.4 VTT的滴定22
• 2.2.5 观察致细胞病变效应22
• 2.2.6 间接免疫荧光检测22-23
• 2.2.7 最低感染复数检测23
• 2.2.8 感染细胞释放病毒的滴度测定23
• 2.3 结果23-25
• 2.3.1 VTT扩增和滴度测定23
• 2.3.2 细胞对VTT的易感性23-24
• 2.3.3 最低感染复数的比较24-25
• 2.3.4 感染细胞上清中的VTT滴度测定和比较25
• 2.4 讨论25-26
• 2.5 本章小结26-28
• 第3章 hMSCs对HCMV的易感性28-46
• 3.1 实验材料28-29
• 3.1.1 病毒和细胞28
• 3.1.2 主要试剂28
• 3.1.3 主要仪器设备28-29
• 3.1.4 琼脂糖凝胶制备29
• 3.2 实验方法29-35
• 3.2.1 HCMV Towne毒株的增殖29
• 3.2.2 HCMV滴度测定29-30
• 3.2.3 细胞形态学观察30
• 3.2.4 间接免疫荧光检测30-31
• 3.2.5 常规PCR法检测31-32
• 3.2.6 比较最低感染复数及CPE32-33
• 3.2.7 感染细胞上清中HCMV核酸拷贝数的测定和比较33-35
• 3.3 结果35-44
• 3.3.1 HCMV滴定结果35-36
• 3.3.2 细胞对HCMV的易感性36-38
• 3.3.3 HCMV感染的细胞上清病毒核酸检测38-39
• 3.3.4 最低感染复数及细胞毒性的比较39-40
• 3.3.6 感染细胞上清HCMV核酸拷贝数测定和比较40-44
• 3.4 讨论44-45
• 3.5 本章小结45-46
• 第4章 hMSCs对EV71, rSeV-HIVgag, rAd5-GFP, r Ad5F35-GFP的易感性46-58
• 4.1 实验材料46-47
• 4.4.1 细胞46
• 4.4.2 病毒来源及保存46-47
• 4.4.3 主要试剂47
• 4.4.4 主要仪器设备47
• 4.2 实验方法47-49
• 4.2.1 病毒扩增和滴度测定47-48
• 4.2.2 永生化hMSCs对EV71易感性的检测48-49
• 4.2.3 永生化hMSCs对rSeV-HIVgag易感性的检测49
• 4.2.4 永生化hMSCs对rAd5-GFP和r Ad5F35-GFP易感性的检测49
• 4.3 结果49-54
• 4.3.1 病毒滴定结果49-50
• 4.3.2 hMSCs对EV71的易感性50-51
• 4.3.3 hMSCs对r SeV-HIVgag的易感性51-52
• 4.3.4 hMSCs对rAd5-GFP和r Ad5F35-GFP的易感性52-54
• 4.4 讨论54-56
• 4.5 本章小结56-58
• 第5章 hMSCs对人流感病毒的易感性研究58-66
• 5.1 实验材料58-59
• 5.1.1 病毒和细胞58
• 5.1.2 主要试剂58
• 5.1.3 主要实验试剂的配制58
• 5.1.4 主要仪器设备58-59
• 5.2 实验方法59-61
• 5.2.1 病毒的分装59
• 5.2.2 病毒滴度测定59-60
• 5.2.3 间接免疫荧光法检测60-61
• 5.2.4 病毒感染细胞上清血凝效价测定61
• 5.3 实验结果61-63
• 5.3.1 流感病毒滴定结果61-62
• 5.3.2 流感病毒核蛋白表达结果62-63
• 5.3.3 病毒感染细胞上清血凝效价测定结果63
• 5.4 讨论63-64
• 5.5 本章小结64-66
• 结论66-68
• 附表68-70
• 参考文献70-74
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文74-76
• 致谢76

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